本发明属于基因工程技术和生物医药领域，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶gme7019、编码基因、工程菌及其应用。
背景技术：
1、包含爪哇正青霉在内的青霉菌在长期的进化过程中获得了特定的酶群，这些酶群可以分解难降解的木质纤维素，因此青霉菌是糖基水解酶的良好来源。青霉属可以生产出高性能的木质纤维素水解胞外酶，与其他真菌种类相比，青霉属具有易于回收、活性高、稳定性高等特点。此外，由于青霉菌具有丰富的遗传多样性，这些菌株也成为生产β-葡萄糖苷酶和其他工业酶的重要来源。因为海水具有取之不尽、用之不竭的特性，是真正可持续利用的资源。因此，可以通过海水代替淡水的方式，尽量减少消耗淡水，同时也可以减少对环境的污染。
2、人参皂苷是人参中最重要的一类药物活性成分，具有多种功效，如抗癌、抗衰老、抗氧化、抗过敏、抗疲劳等。但天然的人参皂苷糖化程度很高，具有复杂的三酰胺骨架和糖基修饰结构，其化学性质和药理作用复杂多变。在这些人参皂苷中，rg3类虽然含量较低但生物活性最为显著，具有抗肿瘤、抗转移性、保护神经、保肝护肝、抗糖尿病和改善血管舒张等多重药理作用，最具有药物开发价值。因此，目前许多研究都集中在如何将大量的人参皂苷转化为人参皂苷20(s)-rg3，后者具有更活跃的药物活性，这一过程主要是去除人参皂苷c-20碳上的葡萄糖糖基。
3、近年来，多项研究尝试利用微生物转化技术将人参皂苷rb1转化为人参皂苷20(s)-rg3，但均无明显效果。已有研究显示，黑曲霉和青霉菌等微生物所表达的粗酶成分复杂，其水解转化人参皂苷rb1的能力选择性较差，因而受到极大限制。重组酶是另外一种实现人参皂苷转化的另一重要途径。重组酶能实现外源的高水平表达，也有少数重组β-葡萄糖苷酶可以在常温下将rb1转化为rg3，但其转化率很低，并且受制于底物浓度和rg3产量的严格限制。到目前为止，尚未发现一种能够将大量人参皂苷转化为人参皂苷20(s)-rg3的重组酶。
技术实现思路
1、在发明人的研究过程中，发明人对爪哇正青霉r57中发现的一种新的β-葡萄糖苷酶gm e7019进行了外源表达、纯化和生化表征。研究结果表明，这种β-葡萄糖苷酶gme7019对不同的糖苷和苷元具有多功能的水解活性，对人参皂苷都具有很好的转化活性。
2、在本发明的第一个方面，本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶gme7019，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
3、该β-葡萄糖苷酶gme7019来源于爪哇正青霉r57的基因组中筛选到的基因gme7019并且在大肠杆菌中表达所得到的，发明人发现其具有良好的β-葡萄糖苷键的水解活性，对人参皂苷rb1、rb2和rd都具有较好的转化能力。其在40℃-60℃温度范围内表现出最高活力和良好的温度稳定性，具有较好的耐高温能力；同时还能够在ph＝5.0-9.0的范围内表现出极高的稳定性(可以承受较宽的ph范围)。此外，该β-葡萄糖苷酶gme7019还具有较强的金属离子耐受性(如cu2+、co2+和zn2+)，而且在这些金属离子的作用下，gme7019的热稳定性能够显著提高。
4、在本发明的第二个方面，还提供了所述β-葡萄糖苷酶gme7019的编码基因；所述编码基因的序列如seq id no.2(原始序列)或seq id no.3(密码子优化后的序列)所示。在ncbi对其氨基酸序列(seq id no.1)的比对中，与aspergillus fischeri nrrl 181糖苷水解酶最高相似度，为70.25％，经过密码子优化后的序列与paenibacillus yonginensis中的糖苷水解酶具有最高相似度，为95.24％。因此，gme7019所编码的β-葡萄糖苷酶可以被认定为一个新酶。
5、由于青霉菌和大肠杆菌的亲缘关系较远，密码子偏好性有所差异，所以本发明选择通过基因合成的方式对目的基因进行密码子优化，使其能够更好的实现外源表达。
6、通过密码子优化本发明中的β-葡萄糖苷酶gme7019真核基因后，在大肠杆菌bl21(de3)中通过0.1mm的iptg诱导表达，经超声破碎得到粗酶，经ni-nta亲和层析纯化，经sds-page验证，得到纯化酶。酶学性质分析发现，该酶热稳定性好，ph稳定性广。该酶在ph为5-9时比较稳定，在4℃的不同缓冲溶液中，经过24h的孵育，其活性仍保持在80％以上。由于海水的酸碱度在7.9-8.4之间，而该酶此酸碱度范围内酶的活性没有任何损失，因此它可以在未来的应用中可以克服水资源匮乏的压力。同时，本发明β-葡萄糖苷酶gme7019还能将大量人参皂苷转化为稀有的人参皂苷，其转化人参皂苷的能力受到有机试剂(zn2+、co2+和cu2+)的促进，这一特性也为应用于生物转化提供了良好的先决条件。本发明的β-葡萄糖苷酶gme7019的制备方法简单，在市场上具有很好的推广和应用价值。
7、在本发明的第三个方面，本发明还提供了一种含有所述编码基因的工程菌。具体是将β-葡萄糖苷酶gme7019的编码基因与pet-28a载体相连得到重组质粒；将重组质粒转入表达宿主菌e.colibl21(de3)中，经0.1mm iptg诱导产酶后，用ni-nta柱纯化β-葡萄糖苷酶gme7019。并基于此提供了一种所述工程菌的全细胞催化剂的制备方法，包括第一步骤：将含有所述编码基因的阳性克隆大肠杆菌接种(接种比例为1:100)至含50μg/ml的lb培养基中，37℃，180rpm震荡培养直至od600达到0.4-0.6，然后冰浴20min，随后加入终浓度为0.1mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，于37℃和180rpm的条件下震荡培养12h。其中，所述第一步骤后还包括第二步骤，所述第二步骤的具体过程为：离心(条件优选为5000×g，4，℃20min)收集细胞后用缓冲液(优选包括500mm nah2po4，300mm氯化钠，10mm咪唑，ph7.4)进行洗涤，过滤后将沉淀悬浮于裂解液中，进行超声细胞破碎，然后将得到的菌悬液进行离心，上清液纯化。其中，所述裂解液的ph为7.4，包括：500mm磷酸二氢钠，300mm氯化钠，10mm咪唑。
8、在本发明的第四个方面，本发明还提供了所述β-葡萄糖苷酶gme7019在催化人参皂苷rb1和人参皂苷rd制备人参皂苷rg3中的应用。其中，催化制备人参皂苷rg3的反应在50mm柠檬酸和ph＝4的磷酸盐缓冲液体系下进行。
9、本发明的有益效果为：本发明提出的β-葡萄糖苷酶gme7019热稳定性好，ph稳定性广，并且具有良好的β-葡萄糖苷键的水解活性，能将大量人参皂苷转化为稀有的人参皂苷rg3；此外，该β-葡萄糖苷酶gme7019还具有较强的金属离子耐受性并且能够在金属离子和有机试剂的条件下促进转化能力，使得其能够在未来的应用中可以克服水资源匮乏的压力，在市场上具有很好的推广和应用价值。
1.一种β-葡萄糖苷酶gme7019，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.一种权利要求1所述β-葡萄糖苷酶gme7019的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的序列如seq id no.2或seq id no.3所示。
4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的序列如seq id no.3所示。
5.一种含有权利要求2至4任一项所述编码基因的工程菌。
6.一种权利要求5所述工程菌的全细胞催化剂的制备方法，其特征在于，包括第一步骤：将所述编码基因的阳性克隆大肠杆菌接种至含50μg/ml的lb培养基中，37℃，180rpm震荡培养直至od600达到0.4-0.6，然后冰浴20min，随后加入终浓度为0.1mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，于37℃和180rpm的条件下震荡培养12h。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述第一步骤后还包括第二步骤，所述第二步骤的具体过程为：离心收集细胞后用缓冲液进行洗涤，过滤后将沉淀悬浮于裂解液中，进行超声细胞破碎，然后将得到的菌悬液进行离心，上清液纯化。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述裂解液的ph为7.4，包括：500mm磷酸二氢钠，300mm氯化钠，10mm咪唑。
9.权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶gme7019在催化人参皂苷rb1和人参皂苷rd制备人参皂苷rg3中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，催化制备人参皂苷rg3的反应在50mm柠檬酸和ph＝4的磷酸盐缓冲液体系下进行。
