本发明属于快速检测，特别涉及一种松材线虫感染的松材疫木快速检测试纸条及其制备和使用方法。
背景技术：
1、传统检测松树是否被松材线虫感染的方法主要有两类。一类是鉴定法，通过对松树进行取样后，再用贝尔曼漏斗法分离线虫，经过在光学显微镜下依据线虫的形态特征或运用pcr技术来鉴定线虫是否为松材线虫，进而判断松材是否被松材线虫感染。另一类是经验法，通过松材的外观病症来辨别，主要有四种指标：(1)针叶呈现红褐色、黄褐色；(2)整株萎蔫、枯死或者部分枝条萎蔫、枯死，但针叶下垂、不脱落；(3)树干部有松褐天牛等媒介昆虫的产卵刻槽、侵入孔；(4)树干部松脂渗出少或者无松脂渗出的松树。鉴定法通常存在费时费工、取不到松材线虫造成假阴性误判的问题，不适于在大面积松树森林片区快速辨别鉴定松树是否感染了松材线虫。经验法判别的松树若被松材线虫感染通常处于感染程度比较重的时期，不利于对松树片区的预防处理。因此，开发简便快捷地辨别松树是否感染松材线虫的检测技术至关紧迫，对有力的限制松材线虫病的蔓延，保护松林植被，减少经济损失意义重大。
技术实现思路
1、为解决上述问题，即解决上述背景技术提出的问题，本发明提出了一种松材线虫感染的松材疫木快速检测试纸条及其制备和使用方法，具体技术方案如下：
2、本发明提供了一种松材线虫感染的松材疫木快速检测试纸条，包括试纸条，所述试纸条上设置有硝酸纤维素膜；所述硝酸纤维素膜上设置c线和t线；t线处涂覆有包被抗原；c线处涂覆有羊抗鼠igg二抗。
3、本发明优选为所述试纸条上设置有金标垫；所述金标垫上涂覆有标签抗体，该标签抗体为胶体金标记的特异性鼠抗单克隆抗体。
4、本发明优选为所述试纸条的主体为底板，底板上依次设置样品垫、缓冲垫-a、金标垫、缓冲垫-b、硝酸纤维素膜和吸水纸；底板上从前端到后端依次设置粘贴样品垫、缓冲垫-a、金标垫、缓冲垫-b、硝酸纤维素膜和吸水纸；粘贴样品垫的后端与缓冲垫-a的前端交叠放置，缓冲垫-a的后端与金标垫的前端交叠放置，金标垫的后端与缓冲垫-b的前端交叠放置，硝酸纤维素膜的前端与缓冲垫-b的后端交叠放置，吸水纸的前端与硝酸纤维素膜的后端交叠放置。
5、本发明优选为所述c线的轴线与硝酸纤维素膜的轴线垂直；t线的轴线与硝酸纤维素膜的轴线垂直；t线位于c线和缓冲垫-b之间。
6、本发明优选为所述吸水纸外层粘附不干胶带ⅰ，从正面包覆到底板背面；所述样品垫、缓冲垫-a、金标垫和缓冲垫-b外层粘附不干胶带ⅱ，从正面包覆到底板背面，不干胶带ⅰ与不干胶带ⅱ不同。
7、本发明优选为所述不干胶带ⅰ上设有指示标识和液位线标识；液位线底部为反应区。
8、本发明另一目的为提供一种上述松材线虫感染的松材疫木快速检测试纸条的制备方法，以下步骤进行：
9、(1)将0.1～1g氯化金粉末溶于100ml超纯水中，制成氯化金溶液；将0.1～1.0g柠檬酸三钠溶解于10ml超纯水中，制成柠檬酸三纳溶液；
10、(2)将0.5～1.5ml氯化金溶液加入到100ml超纯水中，加热至沸腾，然后加入1.0～2.0ml柠檬酸三钠溶液，保持沸腾至全部溶液呈透明酒红色，制成胶体金溶液；
11、(3)将1ml胶体金溶液用k2co3溶液调节ph值为5.0～10.0，再加入10～50μg标签抗体，混合反应10～60min，再加入bsa混合反应10～60min，制成标签抗体-胶体金溶液；bsa在标签抗体-胶体金溶液中的质量浓度为10～50％；
12、(4)将tris、海藻糖和蔗糖溶于水中，用盐酸调节ph值为5.0～9.0，制成标签抗体稀释液；标签抗体稀释液中tris的浓度为0.05～0.5m，海藻糖的质量浓度为2～20％，蔗糖的质量浓度为2～20％；
13、(5)将标签抗体-胶体金溶液离心15-30min，然后分离去除上清液，剩余的沉淀用0.05～1.0ml标签抗体稀释液溶解，制成标签抗体-胶体金工作液；所述离心时的温度为4±2℃，离心时的转速为12000±1000rpm；
14、(6)将tris、pvp、bsa和蔗糖溶于水中，用盐酸调节ph值为5.0～10.0，制成金标垫处理液；金标垫处理液中tris的浓度为0.01～0.5m，pvp的质量浓度为2～15％，bsa的质量浓度为2～15％，蔗糖的质量浓度为2～15％；
15、(7)将tris、pvp、tween-20和蔗糖溶于水中，用盐酸调节ph值为5.0～10.0，制成玻纤处理液；玻纤处理液中tris的浓度为0.01～0.1m，pvp的质量浓度为1～10％，tween-20的质量浓度为1～5％，蔗糖的质量浓度为2～10％；
16、(8)将tris、pvp、酪蛋白钠和蔗糖溶于水中，用盐酸调节ph值为5.0～8.0，制成缓冲垫处理液；玻纤处理液中tris的浓度为0.01～0.1m，pvp的质量浓度为1～10％，酪蛋白钠的质量浓度为0.5～5％，蔗糖的质量浓度为2～10％；
17、(9)将玻璃纤维用玻纤处理液浸没2～8h，然后烘干，制成样品垫；将聚酯膜用金标垫处理液浸没2～8h，然后烘干，制成金标垫；将玻璃纤维用缓冲垫处理液浸没2～8h，然后烘干，制成缓冲垫；
18、(10)将标签抗体-胶体金工作液涂覆在金标垫表面，使其构成标签抗体金标垫；将包被抗原工作液涂覆在硝酸纤维素膜的t线处，将羊抗鼠igg二抗溶液涂覆在硝酸纤维素膜的c线处，其中包被抗原工作液的浓度为1～10mg/ml，羊抗鼠igg二抗溶液的浓度为1～10mg/ml；
19、(11)在底板上依次粘贴样品垫、缓冲垫-a、金标垫、缓冲垫-b、硝酸纤维素膜和吸水纸，然后在底板的上端粘贴绿色不干胶，在底板的下端粘贴白色不干胶，经切条机裁切，制成试纸条。
20、本发明优选为所述标签抗体为胶体金标记的特异性鼠抗单克隆抗体，特异性鼠抗单克隆抗体的制备方法按以下步骤进行：
21、(1)标志分子的获取
22、1)称量被松材线虫感染的松树样本10～20g于50ml ep管中，准确加入30ml 2-氯苯丙氨酸(4ppm)甲醇(-20℃)配制，涡旋振荡15～30s；
23、2)加入5～10g玻璃珠，放入组织研磨器中，55hz研磨60～90s；
24、3)室温超声15～30min；
25、4)8000～12000rpm，4℃离心10～15min，取上清液过0.22μm膜过滤，收集滤液；
26、5)将上述滤液经超临界萃取，制备成标志分子样本(pt-mm)；
27、(2)半抗原的制备
28、1)称取5～10mg pt-mm和10～15mg o-(羧甲基)羟胺半盐酸盐，溶入1ml吡啶，室温搅拌反应18～24h，真空抽干；
29、2)残留物用3～5ml超纯水溶解，用1m naoh将ph调至8.0，用3～6ml苯萃取3次，除去未反应的pt-mm；
30、3)再用1m hcl将ph调至3.0，6～8ml乙酸乙酯萃取4次，收集萃取液，真空抽干，残留物为半抗原pt-mm-羧甲基肟(pt-mm-cmo)；
31、4)取少量样品溶于乙酸乙酯，采用液相色谱-质谱(lc-ms)联用法鉴定(pt-mm-cmo)；
32、(3)人工抗原的制备
33、1)称取3～5mg pt-mm-cmo、2～3mg n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和2～3mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)，溶入1～2ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，室温搅拌反应过夜；
34、2)3000～5000rpm离心5～10min，取上清即获得a液；
35、3)称取8～10mg bsa或6～8mg ova，溶入10～12ml 0.01m pbs缓冲液，将a液缓慢加入载体蛋白溶液，室温搅拌过夜，然后用0.01m pbs透析64～72h，每8h换一次透析液；
36、4)透析后3000～5000rpm离心5～10min，取上清即获得抗原，将抗原分装并保存于-20℃冰箱；此过程获得的抗原可作为抗原工作液使用。
37、(4)单克隆抗体制备
38、1)将抗原与弗氏完全佐剂按1:1等体积混合后充分乳化，制成免疫注射剂；将免疫注射剂向balb/c雌性小鼠进行腹腔注射，获得注射后小鼠；注射量按50～100ug抗原/只；balb/c雌性小鼠的体重为18～20g，鼠龄为6～8周；
39、2)将注射后小鼠培养4周，再次注射免疫注射剂，获得二次注射小鼠，其免疫注射剂为：将抗原与弗氏不完全佐剂按1:1等体积混合后充分乳化得到；注射剂用量与步骤1)用量相等；
40、3)将二次注射小鼠培养2周，按步骤2)的方式再次注射免疫注射剂，注射量按步骤1)两倍的剂量注射，获得三次注射小鼠；
41、4)将三次注射小鼠培养3天后，取出小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞；
42、5)将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞按质量比为5～10﹕1混合，置于无血清的rpmi-1640培养基中混匀，然后在800～1200rpm的条件下离心5min，去除上清液部分，获得沉淀细胞；
43、6)将0.5～0.8ml融合剂加入到5)中所得沉淀细胞中，融合1～5min，然后置于无血清的rpmi-1640培养基中终止融合，在37±0.5℃和800～1200rpm的条件下离心5min，去除上清液部分，获得融合细胞；所述的融合剂为质量浓度为30～50％peg溶液；
44、7)将融合细胞用hat培养基重悬；获得的悬液分装到96孔细胞板中，在37±0.5℃条件下，用5％ co2培养箱培养5天，然后用hat培养基换液培养5天，再用hat培养基半量换液培养5天，再用按体积百分比含1％ht的培养基换液培养；
45、8)融合细胞覆盖96孔细胞板孔底10～50％时，用间接elisa法筛选阳特异性阳性孔；
46、9)采用有限稀释法进行3次克隆，选择一株呈单个克隆生长的细胞株继续克隆培养，直至抗体分泌阳性率大于95％，将其扩大培养，得到一株单克隆抗体细胞株；
47、10)将单克隆抗体细胞株置于10％fbs中的dmem培养基中，接种于6孔培养板，在37±0.5℃条件下，用5％ co2培养箱培养2天，收集上清液；
48、11)将上清液取15ml，在8000～12000rpm条件下离心5～10min，经protein a+g琼脂糖过柱，重复2～3次，再用30～50ml wash buffer清洗柱子；向接收用离心管加入0.1ml浓度100mm的tris，再用elution buffer冲洗柱子；每个接收用离心管再接0.9ml elutionbuffer；用bca法测各个接收管中的溶液的蛋白浓度，将其中浓度最高的两个接收管中的溶液合并起来；用带滤膜的millipore离心管将溶液离心浓缩，再用tbs清洗2次，使溶液浓缩到0.5ml，制成鼠抗单克隆抗体的标签抗体，此过程所制作的单克隆抗体即为特异性鼠抗单克隆抗体。
49、本发明优选为所述的wash buffer中tris-hcl的浓度为100mm，ph值为8.0；所述的elution buffe中glycine的浓度为100mm，ph值为3.0；所述的tbs中tris的浓度为为20mm，nacl的浓度为137mm，ph值为7.6；所述用elution buffer冲洗柱子时，每0.9ml elutionbuffer接收一管。
50、本发明又一目的为提供一种上述松材线虫感染的松材疫木快速检测试纸条的使用方法，(1)将试纸条的样品端垂直向下，插入准备好的检测样本上清液中。试纸条样品端没入样本液的深度约为0.5cm，不要超过箭头上端的标记线；(2)观察c线处和t线处；当c线处显色强于t线处时，判断待测样品为阳性；当c线处显色等于或浅于t线处时，判断待测样品为阴性。
51、本发明的有益技术效果为：操作方法简单，不需要专门的仪器设备，可方便的于林间等现场直接进行检测；检测时间短，结果判定标准统一：可快速检测被松材线虫感染的松木，避免传统检测工艺复杂等问题；可进行独立包装，避免了多个产品包装反复开封受潮的风险，更方便存储和携带。
1.一种松材线虫感染的松材疫木快速检测试纸条，包括试纸条(1)，其特征在于：所述试纸条(1)上设置有硝酸纤维素膜(7)；
2.根据权利要求1所述的松材线虫感染的松材疫木快速检测试纸条，其特征在于：所述试纸条(1)上设置有金标垫(5)；
3.根据权利要求1或2所述的松材线虫感染的松材疫木快速检测试纸条，其特征在于：所述试纸条(1)的主体为底板(2)，底板(2)上依次设置样品垫(3)、缓冲垫-a(4)、金标垫(5)、缓冲垫-b(6)、硝酸纤维素膜(7)和吸水纸(8)；
4.根据权利要求3所述的松材线虫感染的松材疫木快速检测试纸条，其特征在于：所述c线(7-1)的轴线与硝酸纤维素膜(7)的轴线垂直；t线(7-2)的轴线与硝酸纤维素膜(7)的轴线垂直；t线(7-2)位于c线(7-1)和缓冲垫-b(6)之间。
5.根据权利要求3所述的松材线虫感染的松材疫木快速检测试纸条，其特征在于：所述吸水纸(8)外层粘附不干胶带ⅰ(9)，从正面包覆到底板(2)背面；所述样品垫(3)、缓冲垫-a(4)、金标垫(5)和缓冲垫-b(6)外层粘附不干胶带ⅱ(10)，从正面包覆到底板(2)背面，不干胶带ⅰ(9)与不干胶带ⅱ(10)不同。
6.根据权利要求3所述的松材线虫感染的松材疫木快速检测试纸条，其特征在于：所述不干胶带ⅰ(10)上设有指示标识和液位线标识；液位线底部为反应区(12)。
7.权利要求1、2、3、4、5或6所述松材线虫感染的松材疫木快速检测试纸条的制备方法，其特征在于：以下步骤进行：
8.根据权利要求7所述松材线虫感染的松材疫木快速检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述标签抗体为胶体金标记的特异性鼠抗单克隆抗体，特异性鼠抗单克隆抗体的制备方法按以下步骤进行：
9.根据权利要求7所述松材线虫感染的松材疫木快速检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述的wash buffer中tris-hcl的浓度为100mm，ph值为8.0；
10.权利要求1、2、3、4、5或6所述松材线虫感染的松材疫木快速检测试纸条的使用方法，其特征在于：(1)将试纸条的样品端垂直向下，插入准备好的检测样本上清液中。试纸条样品端没入样本液的深度约为0.5cm，不要超过箭头上端的标记线；(2)观察c线处和t线处；当c线处显色强于t线处时，判断待测样品为阳性；当c线处显色等于或浅于t线处时，判断待测样品为阴性。
