本发明属于电化学传感器，具体涉及一种穿透式电化学生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术：
1、活性氧(ros)作为细胞内一种重要的生物信号分子，细胞癌变的生理过程、信号转导通路的调控机制和疾病的发生几乎都与其有着密不可分的联系。过氧化氢(h2o2)是活性氧(ros)的一种，在调节蛋白质合成、细胞凋亡、信号转导和免疫活性等方面发挥重要作用。由于h2o2水平异常与多种疾病相关，如阿尔茨海默病、自身免疫性疾病、心血管疾病和癌症等。目前检测h2o2的方法主要有荧光法、比色法、化学发光法、电化学检测和高效液相色谱法等。基于h2o2的电化学活性，电化学检测因其操作方便、检测限低、检测快等优点而被广泛应用。但是，据调查研究发现，一些电极材料由于成本高、导电性能一般或者稳定性不好的原因，是无法制作廉价且性能优异的电极。除电极材料外，分析模式也会影响电化学检测在线分析的分析性能，如流动注射分析。
2、在传统的电化学流动分析中，最常用的是平面电极，采用的是一种流通模式，在这种情况下，细胞流过电极表面时，只能检测扩散到电极平面上的部分分子，而实际上，细胞生物分子的释放是各个方向的，这势必会因为流通模式的快速传质而限制电化学检测的性能，从而阻碍了对生物信息全方位的获取。专利cn 116203091 a公开了一种基于氟掺杂锡氧化物的电化学生物传感器及其构建方法，电化学生物传感器包括工作电极、参比电极和对电极，工作电极由导电基底经氟掺杂锡氧化物修饰所得，具有较强的检测特异性和较高的灵敏度，但是导电基底选自玻碳和导电玻璃等平面电极，由于从细胞释放的分子在各个方向上扩散，而平面电极只能检测释放在其表面的分子。
3、不锈钢丝网具有3d网状微结构可实现细胞穿过网孔，增加细胞与检测区域的接触面积，与其他传统电极相比，不锈钢丝网具有稳定性高、生物相容性好、耐腐蚀、性价比高和导电性好等特点，而且其含有的ni、cr和fe元素所固有的氧化还原特性，使得不锈钢丝网作为工作电极对细胞释放的活性氧表现出高度精确和灵敏的电流响应。而目前尚未有不锈钢丝网应用于穿透式电化学生物传感器的报道。
技术实现思路
1、为了解决平面电极不能对生物信息全方位获取的技术问题，本发明的目的在于提供一种穿透式电化学生物传感器，不锈钢丝网因其高表面积的网状结构与待测样品的接触面积多；本发明的第二目的在于提供所述穿透式电化学生物传感器的制备方法；本发明的第三目的在于提供所述穿透式电化学生物传感器在检测细胞活性氧中的应用，本发明穿透式电化学生物传感器能够实现对细胞释放的活性氧表现出高度精确和灵敏的电流响应。
2、为达到以上目的，本发明采取以下技术方案：一种穿透式电化学生物传感器，包括工作电极，分别设于所述工作电极上、下两面的上电极固定层和下电极固定层，分别设于所述上电极固定层上表面的参比电极和对电极；所述工作电极为通过塑封限制出检测区域的不锈钢丝网，所述上电极固定层与下电极固定层分别设有与所述检测区域连通的通孔，所述参比电极和对电极的一端设于上电极固定层的通孔的上方，所述上电极固定层的通孔与进样管连通，所述进样管连接进样装置，所述下电极固定层的通孔与出样管连通。
3、进一步地，所述不锈钢丝网的目数为300目，材质为304不锈钢。
4、进一步地，所述参比电极为ag/agcl丝，所述ag/agcl丝的直径为0.5～0.8mm；所述对电极为铂丝，所述铂丝的直径为0.5～0.8mm。
5、进一步地，所述检测区域为直径2mm的圆。
6、进一步地，所述上电极固定层与工作电极之间、下电极固定层与工作电极之间分别设有两面带有粘合剂的硅胶片。
7、进一步地，所述进样装置包括溶剂注射泵、待测样品注射泵和刺激物注射泵，待测样品注射泵和刺激物注射泵分别通过管道与第一混合管道连接，溶剂注射泵通过管道与第一混合管道连接，第一混合管道与第二混合管道连接，第二混合管道与进样管连接。
8、上述的穿透式电化学生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
9、(1)将预处理后的不锈钢丝网塑封处理限制出检测区域，得到工作电极；
10、(2)制作进样管、出样管，以及制作带有通孔的上电极固定层、下电极固定层；
11、(3)步骤(1)得到工作电极的上、下面分别设置步骤(2)得到的上电极固定层和下电极固定层，通孔与检测区域连通；将对电极和参比电极固定在上电极固定层的上表面且对电极和参比电极的一端设于上电极固定层的通孔的上方；
12、(4)将步骤(2)得到的进样管与上电极固定层的通孔进行粘接连通、出样管与下电极固定层的通孔进行粘接连通，将进样管与进样装置连接，得到穿透式电化学生物传感器。
13、进一步地，步骤(1)中，所述预处理为将不锈钢丝网经清洗并烘干；所述清洗为依次使用丙酮、乙醇、双蒸水超声清洗10～15min；所述烘干为在60℃烘箱中干燥。
14、进一步地，步骤(1)中，所述塑封处理之后进行裁剪成长度为15～25mm、宽度为8～12mm的片状物。
15、上述的穿透式电化学生物传感器在检测细胞活性氧中的应用。
16、与现有技术相比，本发明的有益效果：
17、(1)将塑封限制出检测区域的不锈钢丝网作为工作电极集成在3d打印装置中，采用流通穿透的模式进行电化学流动注射分析，与平面电极的流通模式不同，本发明的流通模式利用不锈钢丝网的网状微孔结构，在细胞穿过网孔的同时，细胞释放的生物分子在网状电极上产生电化学信号，以此来实现细胞监测，很大程度地提高传感器性能，可应用于细胞释放的过氧化氢(h2o2)和活性氧(ros)的灵敏分析，揭示了网状电极在电化学流动注射分析中的潜力及其在生物测定中的可能扩展；传感器还增大了电极与待测物的接触面积，电极可以与样品充分接触，提高了检测效率；由于该传感器具有良好的生物相容性、高灵敏度和选择性，成功实现了hela细胞释放ros的在线监测，表明该传感器可应用于活细胞的在线监测，所制备的传感器性能优异，hela细胞进样一次最低检测数目可为3个；另外，传感器具有优异的稳定性和重现性，有利于在实际检测中长期使用；
18、(2)通过穿透式电化学生物传感器与注射泵连接，可将传统化学分析中的手工操作实现自动化，且在样品进样时可以通过注射泵严格控制进样体积，不仅可以减少样品的损耗，还可以减少因人为因素导致的误差；在检测时，穿透式电化学生物传感器的整体为密封状态，可以减少外界环境对待测物的影响，起到防污的效果，使得检测结果更真实有效；
19、(3)不锈钢丝网具有优异的导电性和低廉的成本，使用不锈钢丝网制备工作电极，大大降低了玻碳、金和铂等材料制作工作电极的成本；电极无需修饰，制作过程简便，可在短时间内批量制作。
1.一种穿透式电化学生物传感器，其特征在于，包括工作电极，分别设于所述工作电极上、下两面的上电极固定层和下电极固定层，分别设于所述上电极固定层上表面的参比电极和对电极；所述工作电极为通过塑封限制出检测区域的不锈钢丝网，所述上电极固定层与下电极固定层分别设有与所述检测区域连通的通孔，所述参比电极和对电极的一端设于上电极固定层的通孔的上方，所述上电极固定层的通孔与进样管连通，所述进样管连接进样装置，所述下电极固定层的通孔与出样管连通。
2.根据权利要求1所述的穿透式电化学生物传感器，其特征在于，所述不锈钢丝网的目数为300目，材质为304不锈钢。
3.根据权利要求1所述的穿透式电化学生物传感器，其特征在于，所述参比电极为ag/agcl丝，所述ag/agcl丝的直径为0.5～0.8mm；所述对电极为铂丝，所述铂丝的直径为0.5～0.8mm。
4.根据权利要求1所述的穿透式电化学生物传感器，其特征在于，所述检测区域为直径2mm的圆。
5.根据权利要求1所述的穿透式电化学生物传感器，其特征在于，所述上电极固定层与工作电极之间、下电极固定层与工作电极之间分别设有两面带有粘合剂的硅胶片。
6.根据权利要求1所述的穿透式电化学生物传感器，其特征在于，所述进样装置包括溶剂注射泵、待测样品注射泵和刺激物注射泵，待测样品注射泵和刺激物注射泵分别通过管道与第一混合管道连接，溶剂注射泵通过管道与第一混合管道连接，第一混合管道与第二混合管道连接，第二混合管道与进样管连接。
7.权利要求1～6任一项所述的穿透式电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述预处理为将不锈钢丝网经清洗并烘干；所述清洗为依次使用丙酮、乙醇、双蒸水超声清洗10～15min；所述烘干为在60℃烘箱中干燥。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将不锈钢丝网塑封处理之后进行裁剪成长度为15～25mm、宽度为8～12mm的片状物。
10.权利要求1～6任一项所述的穿透式电化学生物传感器在检测细胞活性氧中的应用。
