本发明属于四环素类抗生素检测，具体涉及一种cds@nh2-mil-88b@rmip纳米酶及其比色-荧光双模传感方法。
背景技术：
1、土霉素(otc)是一种典型的四环素类抗生素。然而，超过75％未被吸收的otc以尿液和粪便的形式直接排放到环境中，对生态系统和人类健康构成了巨大威胁。因此，有必要检测环境中残留的otc。相较于传统的检测方法，如液相色谱-质谱法(lc-ms)、高效液相色谱-紫外光谱法(hplc-uv)和毛细管电泳-紫外光谱法(ce-uv)等，基于纳米酶的比色(cl)法和荧光法因其操作简便、快速、成本低廉等优点而备受关注。但基于纳米酶的比色传感技术，主要是借助纳米酶自身具有的类过氧化物酶活性，可以将显色剂氧化成有色溶液，从而实现可视化检测，并通过对有色溶液吸光度的检测对相关物质进行定量分析。但是其特异性识别性能较差，不能准确对未知样品中的靶分子进行定性、定量检测。
2、另外，基于纳米酶的荧光法，其对四环素类抗生素样品的检测浓度最大上限为1×10-7mol/l，属于纳摩尔级别的检测，当待测样品中的四环素类抗生素的含量超出荧光法检测的最大上限时，便不能准确的获悉四环素类抗生素在待测样品中的具体含量，即不能实现待测样品中四环素类抗生素的定量分析。但对于基于纳米酶的比色法，其对四环素类抗生素样品的的检测浓度最大上限高于1×10-7mol/l，属于微摩尔级别的检测，当待测样品中的四环素类抗生素的含量超出荧光法检测的最大上限时，可以采用比色法实现待测样品中的四环素类抗生素的定量分析，大大拓宽了四环素类抗生素的线性定量检测范围。
3、金属-有机骨架化合物(mofs)是指无机金属中心与有机官能团通过共价键或离子共价键相互连接，共同构筑的具有规则或者孔穴结构的晶态多孔材料。大多数金属-有机骨架化合物本身就具有类过氧化物酶活性，是常用的纳米酶。金属-有机骨架化合物由于物理结构不同，表现出不同的光学催化特性。而分子印迹技术，是在合成聚合物中创建人工识别位点的新型技术。该技术合成的分子印迹聚合物(mips)可以通过共价键、半共价键、非共价键与靶分子结合在一起，对靶分子有特异性识别和选择性吸附的能力，具有制备成本低廉、稳定性好和可重复性使用等优点。
4、研究发现，单纯的将金属-有机骨架化合物作为纳米酶，不具备对靶分子特异性识别和选择性吸附的能力，不能实现未知样品中靶分子的准确定性、定量分析，将mof与mips复合后，能够赋予复合纳米酶良好的特异性识别和选择性吸附性，但纳米酶的比色信号会大大减弱，检测的灵敏度显著降低，也不能实现未知样品中靶分子的准确定性、定量分析。
技术实现思路
1、现有技术中存在的问题是：单纯的将金属-有机骨架化合物作为纳米酶，不具备对靶分子特异性识别和选择性吸附的能力，不能实现未知样品中靶分子的准确定性、定量分析。针对上述问题，本发明提供一种cds@nh2-mil-88b@rmip纳米酶，制备方法包括以下步骤：
2、(1)原位聚合法制备cds@nh2-mil-88b
3、将glu均匀分散在溶剂中，所述glu在溶液中的质量浓度为0.1-2.5mg/ml，所述溶剂为水与乙醇按照体积比1:7-9组成的混合溶液，之后加入nh2-mil-88b，所述nh2-mil-88b与glu的质量比为1:0.1-2.5，充分搅拌吸附得到分散液，之后对所获分散液进行离心分离，取固体产物，之后对固体产物进行洗涤、干燥并研磨，得到粉末状材料；
4、之后，将所获粉末状材料置于管式炉中，在惰性气体氛围下恒温煅烧，煅烧结束后，之后，冷却至室温，将所获材料继续研磨至所需粒径，即得；
5、(2)制备cds@nh2-mil-88b@rmip
6、将步骤(1)所获cds@nh2-mil-88b与otc均匀分散在乙醇中，所述cds@nh2-mil-88b与otc的质量比为50:11.5-23，所述otc在乙醇中的质量浓度为1.27-2.5mg/ml，之后，在反应体系中加入功能单体aptes，搅拌均匀后，加入teos和醋酸水溶液，所述aptes与otc的用量比为120-35ml:11.5mg，所述teos与aptes的体积比为112.5-300:35，所述醋酸水溶液与aptes的体积比为25-50:3.5，所述醋酸水溶液的质量浓度是0.1mm，搅拌均匀后，边搅拌边向反应体系中持续通入气体，室温下搅拌反应6-12h，反应停止，之后对反应产物进行离心、洗脱、干燥，即得。
7、具体地，步骤(1)中粉末状材料的平均粒径为110nm。
8、具体地，步骤(1)中离心，转速为8000-12000rpm，时间为5-10min。
9、具体地，步骤(1)中搅拌吸附，搅拌转速为300-500rpm，搅拌时间6-12h。
10、具体地，所述洗涤是指采用dmf洗涤至少3次，再用乙醇洗涤至少2次。
11、具体地，所述干燥是指于45-60℃下烘干。
12、具体地，步骤(1)中恒温煅烧，恒温煅烧温度为200-300℃，时间为2-4h，升温速率是2-5℃/min，自然降温。
13、具体地，步骤(1)中煅烧后所获材料的平均粒径为100nm。
14、具体地，步骤(2)中所述气体包括氮气、惰性气体中的至少一种。
15、具体地，步骤(2)中离心，转速为8000-12000rpm，时间为5-10min。
16、具体地，步骤(2)中洗脱，是指采用醋酸与甲醇形成的混合溶液，重复洗脱6-10次，所述醋酸与甲醇的体积比为95:5-99:1。
17、具体地，利用一种cds@nh2-mil-88b@rmip纳米酶对四环素类抗生素进行比色-荧光传感检测的方法，包括以下步骤：
18、(1)溶液的配制
19、将cds@nh2-mil-88b@rmip纳米酶分散在去离子水中，所述
20、cds@nh2-mil-88b@rmip纳米酶在水中的浓度为1mg/ml，得到分散液ⅰ；
21、将双氧水溶于去离子水中，所述双氧水在水中的浓度为1mm，得到分散液ⅱ；
22、将显色剂分散在无水乙醇中，所述显色剂在无水乙醇中的浓度为10mm，得到分散液ⅲ；
23、(2)采用比色法或荧光法对环境中四环素类抗生素的样品进行定性、定量检测。
24、具体地，所述显色剂包括但不限于tmb、opd、abts中的至少一种。
25、具体地，采用比色法或荧光法对环境中四环素类抗生素的样品进行定性、定量检测的方法，包括以下步骤：
26、(1)配制四环素类抗生素溶液
27、采用去离子水作为溶剂溶解四环素类抗生素，并逐级稀释得到浓度分别为1.0×10-11、5.0×10-11、1.0×10-10、5.0×10-10、1.0×10-9、5.0×10-9、1.0×10-8、5.0×10-8、1.0×10-7、5.0×10-7、1.0×10-6、5.0×10-6、1.0×10-5mol·l-1的四环素类抗生素溶液；
28、(2)将不同浓度的四环素类抗生素溶液、分散液ⅰ分别加入到0.1m醋酸-水缓冲溶液中孵育15min，得到不同浓度的孵育液ⅰ，所述四环素类抗生素溶液与分散液ⅰ、0.1m醋酸-水缓冲溶液的体积比为1:1:8；
29、(3)采用荧光分光光度计检测并记录孵育液ⅰ在450nm处的荧光强度，并根据不同浓度的孵育液ⅰ在450nm处的荧光强度与其浓度对数值之间的线性关系，绘制标准曲线ⅰ；
30、(4)将待测样品液、分散液ⅰ加入到0.1m醋酸-水缓冲溶液中孵育15min，得到孵育液ⅱ，所述待测样品液与分散液ⅰ、0.1m醋酸-水缓冲溶液的体积比为1:1:8；
31、(5)采用荧光分光光度计检测并记录孵育液ⅱ在450nm处的荧光强度，并带入到步骤(3)获得的标准曲线ⅰ中，计算得到待测样品液中四环素类抗生素的含量，当待测样品中四环素类抗生素的含量高于1×10-7m时，会超出荧光法的检测上限，需对待测样品液进行比色法检测，即进行如下步骤(6)-(7)；
32、(6)在不同浓度的孵育液ⅰ中加入分散液ⅱ、分散液ⅲ，室温下反应3-5min，得到孵育液ⅲ，所述孵育液ⅰ与分散液ⅱ、分散液ⅲ的体积比为8:1:1，之后采用紫外分光光度计检测并记录孵育液ⅲ在652nm处的吸光度，并根据不同浓度的孵育液ⅲ在652nm处的吸光度与其浓度对数值之间的线性关系，绘制标准曲线ⅱ；
33、(7)在待测样品液中加入分散液ⅱ、分散液ⅲ，室温下反应3-5min，得到孵育液ⅳ，所述孵育液ⅳ与分散液ⅱ、分散液ⅲ的体积比为8:1:1，之后采用紫外分光光度计检测并记录孵育液ⅳ在652nm处的吸光度，并带入到步骤(6)获得的标准曲线ⅱ中，计算得到待测样品液中四环素类抗生素的具体含量。
34、本发明具有如下的有益效果：
35、(1)本发明通过孔隙原位限域的方法在nh2-mil-88b材料的孔隙中原位碳化生成了荧光碳量子点(cds)，获得了cds@nh2-mil-88b纳米酶复合材料，相比其他将cds与mof材料复合得到的复合材料，类酶活性更好、荧光强度更大，抗干扰能力更强；
36、(2)本发明将荧光和比色方法相结合，提出了一种双模传感策略构建，提高了检测的可靠性和准确性，拓宽了检测范围；
37、(3)本发明通过调控cds@nh2-mil-88b与分子印迹、otc之间的键合关系，增强了荧光和比色信号，这使得传感器更加灵敏，信号响应更快；
38、(4)本发明构建的荧光比色双模传感器用于otc的检测，灵敏度高、稳定性好、线性范围宽，达到了1×10-11-1×10-5mol·l-1；
39、(5)本发明构建的比色-荧光双模传感器，具有良好的应用前景。
40、说明书附图：
41、图1：实施例1所获纳米酶荧光法检测待测样品液过程中利用荧光强度与otc浓度的对数值之间的线性关系绘制的标准曲线。
42、图2：实施例1所获纳米酶比色法检测待测样品液过程中利用吸光度与otc浓度的对数值之间的线性关系绘制的标准曲线。
43、图3：实施例1所获cds@nh2-mil-88b@rmip的高分辨透射电镜元素分析图像。
1.一种cds@nh2-mil-88b@rmip纳米酶，其特征在于，具有类过氧化物酶催化活性，制备方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种cds@nh2-mil-88b@rmip纳米酶，其特征在于，步骤(1)中粉末状材料的平均粒径为110nm。
3.根据权利要求1所述的一种cds@nh2-mil-88b@rmip纳米酶，其特征在于，步骤(1)中离心，转速为8000-12000rpm，时间为5-10min。
4.根据权利要求1所述的一种cds@nh2-mil-88b@rmip纳米酶，其特征在于，步骤(1)中搅拌吸附，搅拌转速为300-500rpm，搅拌时间6-12h。
5.根据权利要求1所述的一种cds@nh2-mil-88b@rmip纳米酶，其特征在于，步骤(1)中恒温煅烧，恒温煅烧温度为200-300℃，时间为2-4h，升温速率是2-5℃/min，自然降温。
6.根据权利要求1所述的一种cds@nh2-mil-88b@rmip纳米酶，其特征在于，步骤(1)中煅烧后所获材料的平均粒径为100nm。
7.根据权利要求1所述的一种cds@nh2-mil-88b@rmip纳米酶，其特征在于，步骤(2)中洗脱，是指采用醋酸与甲醇形成的混合溶液，重复洗脱6-10次，所述醋酸与甲醇的体积比为95:5-99:1。
8.根据权利要求1所述的一种cds@nh2-mil-88b@rmip纳米酶对四环素类抗生素进行比色-荧光传感检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的一种cds@nh2-mil-88b@rmip纳米酶对四环素类抗生素进行比色-荧光传感检测的方法，其特征在于，所述显色剂包括但不限于tmb、opd、abts中的至少一种。
10.根据权利要求8所述的一种cds@nh2-mil-88b@rmip纳米酶对四环素类抗生素进行比色-荧光传感检测的方法，其特征在于，采用比色法或荧光法对环境中四环素类抗生素的样品进行定性、定量检测的方法包括以下步骤：
