本发明属于合成生物学技术和生物能源。针对模式产电微生物希瓦氏菌shewanella oneidensis mr-1，运用合成生物学策略进行细胞形态调控，通过调控细胞骨架增加细胞宽度，进而提高希瓦氏菌的胞外电子传递能力的方法。背景介绍电能细胞是一类能够与外界环境或其他细胞进行电子交换的电活性微生物。其广泛分布于细菌、真菌、古细菌中，目前已分离筛选出上百种具有电活性的微生物，包括向外界环境释放电子的“产电细胞”，以及从外界环境获取电子的“噬电细胞”。以电能细胞为核心构建的多种微生物电催化系统，为解决我国能源和环境等重大需求，提供了极具发展潜力的解决方案，也是国际学术研究前沿的热点和新兴领域。迄今为止，有两种胞外电子传递机制被广泛认可。即通过外膜c型细胞色素或导电纳米线与电极进行直接接触电子传递，以及通过可溶性电子传递载体（如黄素类、吩嗪类、醌类等）与电极之间进行间接地电子传递。奥奈达希瓦氏菌shewanella oneidensis mr-1作为一种经典的模式电能细胞，主要通过mtr途径进行直接电子传递和核黄素进行间接电子传递，目前已有不少研究致力于通过合成生物学策略强化s. oneidensis mr-1的胞外电子传递速率。当前的合成生物学改造策略主要致力于拓宽底物利用谱、提升胞内电子池、过表达细胞色素、增强可溶性电子载体合成、强化生物膜形成以及增强全局调控等，都起到了提高产电的正向效果。近年来，通过调控基因来改造细菌细胞形态的形态工程成为改进生物制造的一种新方法。这些与细胞形态相关的基因同时参与细胞生长、细胞伸长或细胞分裂，因此细胞形态也受到细胞分裂和细胞伸长等过程的调控。通过形态工程，细菌细胞的形状可以如预期的那样从杆状变化到球形，或者由小到大。这些形态变化随后影响细胞生长代谢速率，从而影响小分子产物合成与分泌、以及包涵体产物的积累和分离。目前已有很多研究将细菌形态工程用于化学品，如乙偶姻、聚羟基脂肪酸酯和聚乳酸-3-羟基丁酸酯的生产。然而，探究细胞尺寸和细胞能量代谢两间的关系的研究较少。最近的一项研究显示，用细胞分裂抑制剂顺铂处理电活性微生物s. oneidensis mr-1可将杆状细胞转变为细长的丝状形态，这将输出电流密度从野生型111 ma/m2提高到顺铂处理后646 ma/m2。尽管如此，操纵细胞尺寸的方法及其对细胞电生理的具体调控机制尚未建立。因此，本发明运用合成生物学策略对模式产电微生物希瓦氏菌s. oneidensismr-1进行细胞形态改造，通过表达反义rna抑制细胞伸长体形成相关基因的表达，调控控制细胞宽度的伸长体，构建了4种不同宽度的工程菌株，通过电化学、生理代谢并结合转录组学从胞内电子产生、胞外电子转移和电活性生物膜形成三个方面，系统地阐明了细胞变宽对电生理的影响。为提高希瓦氏菌的电子传递效率提供有效工程策略。
背景技术：
技术实现思路
1、本发明解决的问题：
2、本发明的目的是克服现有技术的不足，针对细胞形态变化对胞外电子传递速率的影响这一关键科学问题，首先运用合成生物学策略对模式产电微生物希瓦氏菌shewanellaoneidensis mr-1进行细胞形态改造，通过表达反义rna抑制细胞伸长体形成相关蛋白编码基因的表达，构建了4种不同宽度的工程菌株，通过电化学、生理代谢以及转录组学从胞内电子产生、胞外电子转移和电活性生物膜形成三个方面，系统地阐明了细胞变宽对电生理的影响。结果表明，抑制细胞骨架蛋白的表达能够增加细胞的宽度，从而强化电活性生物膜形成的初始粘附和垂直扩展过程，增加电活性生物膜厚度；同时细胞变宽能提高c型细胞色素表达水平，从而促进直接电子传递。本发明为利用形态工程改造电活性微生物、促进工业应用提供了新思路。
3、本发明的技术方案：
4、为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
5、本发明提供了一种调控细胞骨架提高希瓦氏菌电子传递能力的方法，包括如下步骤：
6、（1）筛选与细胞伸长体形成相关的4个蛋白质（mreb、mrec、mred和rodz），通过表达反义rna抑制其编码基因（mreb、mrec、mred和rodz）的表达而使细胞变宽；
7、（2）运用扫描电子显微镜和共聚焦激光扫描显微镜观察细胞和生物膜形态；
8、（3）运用imagej图像处理软件进行细胞长度和宽度的测量并计算工程菌株细胞体积和比表面积；
9、（4）利用电化学工作站对菌株进行电化学表征，测定工程菌株的计时电流曲线，循环伏安曲线、线性伏安曲线以及阻抗谱，从而计算菌株输出电压、电流密度、功率密度、电活性细胞色素密度、电化学阻抗、库伦效率以及电子交换能力；
10、（5）对工程菌株进行电生理表征，具体包括：①测量细胞表面疏水性，生物膜厚度及导电性；②测量细胞色素、核黄素产量及乳酸消耗情况；
11、其中，所述的步骤（1）中筛选得到基因mreb的反义rna序列如seq id no.1所示；基因mrec的反义rna序列如seq id no.2所示；基因，mred的反义rna序列如seq id no.3所示；基因rodz的反义rna序列如seq id no.4所示。
12、步骤（3）所述细胞长度、宽度和体积测量计算方式为：通过imagej软件对sem图片上单个细胞的长度和宽度进行测量，对于每个细菌株，测量了10个单独的细胞，以计算其mcl（平均细胞长度）和mcw（平均细胞宽度）。进而细胞棒状模型，计算平均细胞体积（mcv）、平均细胞表面积（msa）和比表面积（ssa），计算公式如（1）-（3）：
13、
14、
15、
16、其中，l是细胞的长度，d是细胞的宽度。根据公式（3），当l>>d时，ssa在很大程度上受到细胞宽度d的影响，即ssa大约与1/d成正比。
17、步骤（4）所述工程菌株的输出电压、电流密度和功率密度测定等电化学表征，是以在1 mm 异丙基-β-d-硫代半乳糖苷、50 mg/l卡那霉素的100 ml lb液体培养基中培养得到的发酵液作为阳极生物催化剂，按照最终od600=0.5接种到阳极室，而阴极室加入铁氰化钾溶液作为电子受体，以此构建的微生物燃料电池双极室中进行表征的。
18、本发明的有益效果：
19、本发明通过表达反义rna抑制细胞伸长体形成相关基因的表达，构建了4种不同宽度的工程菌株asmreb、asmrec、asmred和asrodz，通过电化学、生理代谢以及转录组学从胞内电子产生、胞外电子转移和电活性生物膜形成三个方面，系统地阐明了细胞变宽对电生理的影响。结果表明，抑制细胞骨架蛋白的表达能够增加细胞的长宽度，从而强化电活性生物膜形成的初始粘附和垂直扩展过程，增加电活性生物膜厚度；同时细胞变宽能提高c型细胞色素表达水平，从而促进直接电子传递。本发明为利用形态工程改造电活性微生物提高电子传递速率、促进电活性微生物工业应用提供了新思路。其中，工程菌株asmred表现出了最大的细胞宽度（0.57±0.04 µm），是野生型的1.9倍，细胞体积也达到最高（1.04±0.33 µm3），是wt的8.0倍。电化学测试结果表明，最优菌株asmred的功率密度达到 169.1 mw/m2，是野生型的 2.3 倍。
1.一种调控细胞骨架提高希瓦氏菌电子传递能力的方法；其特征是：包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征是：筛选得到基因mreb的反义rna序列如seq idno.1所示；基因mrec的反义rna序列如seq id no.2所示；基因，mred的反义rna序列如seqid no.3所示；基因rodz的反义rna序列如seq id no.4所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是：细胞长度、宽度和体积测量计算方式为：通过imagej软件对sem图片上单个细胞的长度和宽度进行测量，对于每个细菌株，测量了10个单独的细胞，以计算其mcl（平均细胞长度）和mcw（平均细胞宽度），进而细胞棒状模型，计算平均细胞体积（mcv）、平均细胞表面积（msa）和比表面积（ssa），计算公式如（1）-（3）：
4.如权利要求1所述的方法；其特征是：工程菌株的输出电压、电流密度和功率密度测定等电化学表征，是以在1 mm 异丙基-β-d-硫代半乳糖苷、50 mg/l卡那霉素的100 ml lb液体培养基中培养得到的发酵液作为阳极生物催化剂，按照最终od600=0.5接种到阳极室，而阴极室加入铁氰化钾溶液作为电子受体，以此构建的微生物燃料电池双极室中进行表征的。
