本发明涉及人工基因应用，具体涉及一种用于靶向识别膀胱癌细胞的重组腺相关病毒载体及其应用。
背景技术：
1、膀胱癌(bc)是一种常见的恶性肿瘤，主要起源于膀胱的上皮粘膜层。尽管现代医学已经发展出多种治疗手段，包括外科手术切除、放射治疗、化学药物治疗以及靶向治疗，但在治疗效果持久性、防止肿瘤复发和转移等方面仍存在明显挑战。特别是在早期诊断、治疗耐药性以及个体化治疗策略方面，膀胱癌的管理需要更多创新方案。此外，治疗过程中可能出现的副作用和患者生活质量的降低也是我们必须面对的问题。因此，寻找新的治疗靶点、开发新的药物和治疗方法、以及提高早期诊断的准确性，对于提高膀胱癌患者的生存率和生活质量具有至关重要的意义。
2、plz4(氨基酸序列:qdgrmgf)是一段7肽序列，据研究报道，plz4可与膀胱癌细胞表面特异性结合，而不与正常上皮细胞作用。可用于膀胱癌靶向药物的释放、光热治疗等。直接使用plz4治疗膀胱癌虽然具有靶向特性，但由于多肽的低稳定性和生物可用性、有限的靶向性、药物输送障碍、单一治疗效果的限制以及潜在的副作用和安全性等问题，尽管plz4在靶向膀胱癌方面具有良好前景，但其临床应用仍然面临诸多挑战。
3、重组腺相关病毒(raav)是目前临床前和临床应用中领先的体内基因治疗递送载体。由于其高转导效率、广泛的组织亲和性、持久的转基因表达及安全性，raav基因治疗在针对单基因疾病的临床试验中表现出优良的结果，如a型血友病、遗传性视网膜疾病、脂蛋白脂肪酶缺乏症。尽管重组腺相关病毒(raav)在临床前和临床应用中作为基因治疗递送载体显示出优异的转导效率、广泛的组织亲和性、持久的转基因表达及良好的安全性，但其在治疗应用中主要缺点是缺乏组织特异性。这意味着野生型raav在体内无法特异性地靶向特定细胞或组织，可能导致治疗效果分散，增加了对非靶细胞的潜在影响，限制了其在特定疾病(如肿瘤)治疗中的应用效果和安全性。
技术实现思路
1、本发明提供了一种用于靶向识别膀胱癌细胞的重组腺相关病毒载体，提出将plz4多肽嵌入aav载体衣壳蛋白，以增强对膀胱癌的特异性靶向和治疗稳定性，不仅充分利用了plz4多肽的膀胱癌细胞特异性结合能力，还通过aav载体的高效递送系统，提高了治疗分子的体内稳定性和靶向效率，克服了plz4与aav载体单独使用的技术难题，有望显著提升膀胱癌的治疗效果。
2、本发明采用的技术方案如下：
3、一种用于靶向识别膀胱癌细胞的重组腺相关病毒载体，所述重组腺相关病毒载体以重组腺相关病毒的衣壳蛋白作为基础载体，再将plz4肽精确插入到基础载体的第588个和第589个氨基酸之间，最终得到的重组腺相关病毒载体的氨基酸序列如seq id no:1所示。
4、seq id no:1：maadgylpdwlednlsegirewwalkpgapqpkanqqhqdnargl vlpgykylgpgngldkgepvnaadaaalehdkaydqqlkagdnpylkynhadaefqerlkedtsfggnlgravfqakkrlleplglveeaaktapgkkrpveqspqepdssagigksgaqpakkrlnfgqtgdtesvpdpqpigeppaapsgvgsltmasgggapvadnnegadgvgsssgnwhcdsqwlgdrvittstrtwalptynnhlykqisnstsggssndnayfgystpwgyfdfnrfhchfsprdwqrlinnnwgfrpkrlnfklfniqvkevtdnngvktiannltstvqvftdsdyqlpyvlgsahegclppfpadvfmipqygyltlndgsqavgrssfycleyfpsqmlrtgnnfqfsyefenvpfhssyahsqsldrlmnplidqylyylsktingsgqnqqtlkfsvagpsnmavqgrnyipgpsyrqqrvsttvtqnnnsefawpgasswalngrnslmnpgpamashkegedrffplsgslifgkqgtgrdnvdadkvmitneeeikttnpvatesygqvatnhqsaqqdgrmgfaqaqtgwvqnqgilpgmvwqdrdvylqgpiwakiphtdgnfhpsplmggfgmkhpppqilikntpvpadpptafnkdklnsfitqystgqvsveiewelqkenskrwnpeiqytsnyyksnnvefavntegvyseprpigtryltrnl。
5、作为优选地，所述重组腺相关病毒载体由蛋白对应的碱基序列翻录得到，即先通过分子克隆技术，将plz4肽编码序列对应的碱基序列通过重组dna技术精确插入到基础载体对应氨基酸的碱基序列处，最终得到的重组腺相关病毒载体的碱基序列如seq id no:2所示。
6、seq id no:2：atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacaaccttagtgaaggaattcgcgagtggtgggctttg aaacctggagcccctcaacccaaggcaaatcaacaacatcaagacaacgctcgaggtcttgtgcttccgggttacaaataccttggacccggcaacggactcgacaagggggagccggtcaacgcagcagacgcggcggccctcgagcacgacaaggcctacgaccagcagctcaaggccggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgccgagttccaggagcggctcaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgagcagtcttccaggccaaaaagaggcttcttgaacctcttggtctggttgaggaagcggctaagacggctcctggaaagaagaggcctgtagagcagtctcctcaggaaccggactcctccgcgggtattggcaaatcgggtgcacagcccgctaaaaagagactcaatttcggtcagactggcgacacagagtcagtcccagaccctcaaccaatcggagaacctcccgcagccccctcaggtgtgggatctcttacaatggcttcaggtggtggcgcaccagtggcagacaataacgaaggtgccgatggagtgggtagttcctcgggaaattggcattgcgattcccaatggctgggggacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaatcacctctacaagcaaatctccaacagcacatctggaggatcttcaaatgacaacgcctacttcggctacagcaccccctgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttctcaccacgtgactggcagcgactcatcaacaacaactggggattccggcctaagcgactcaacttcaagctcttcaacattcaggtcaaagaggttacggacaacaatggagtcaagaccatcgccaataaccttaccagcacggtccaggtcttcacggactcagactatcagctcccgtacgtgctcgggtcggctcacgagggctgcctcccgccgttcccagcggacgttttcatgattcctcagtacgggtatctgacgcttaatgatggaagccaggccgtgggtcgttcgtccttttactgcctggaatatttcccgtcgcaaatgctaagaacgggtaacaacttccagttcagctacgagtttgagaacgtacctttccatagcagctacgctcacagccaaagcctggaccgactaatgaatccactcatcgaccaatacttgtactatctctcaaagactattaacggttctggacagaatcaacaaacgctaaaattcagtgtggccggacccagcaacatggctgtccagggaagaaactacatacctggacccagctaccgacaacaacgtgtctcaaccactgtgactcaaaacaacaacagcgaatttgcttggcctggagcttcttcttgggctctcaatggacgtaatagcttgatgaatcctggacctgctatggccagccacaaagaaggagaggaccgtttctttcctttgtctggatctttaatttttggcaaacaaggaactggaagagacaacgtggatgcggacaaagtcatgataaccaacgaagaagaaattaaaactactaacccggtagcaacggagtcctatggacaagtggccacaaaccaccagagtgcccaacaggacggacgaatgggattcgcacaggcgcagaccggctgggttcaaaaccaaggaatacttccgggtatggtttggcaggacagagatgtgtacctgcaaggacccatttgggccaaaattcctcacacggacggcaactttcacccttctccgctgatgggagggtttggaatgaagcacccgcctcctcagatcctcatcaaaaacacacctgtacctgcggatcctccaacggccttcaacaaggacaagctgaactctttcatcacccagtattctactggccaagtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaagcgctggaacccggagatccagtacacttccaactattacaagtctaataatgttgaatttgctgttaatactgaaggtgtatatagtgaaccccgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaa。
7、更优地，所述重组腺相关病毒载体的后端还依次连有sv40增强子、htert突变型启动子和治疗基因。
8、更进一步地，所述sv40增强子、htert突变型启动子的碱基序列分别如seq id no:3、seq id no:4所示。
9、seq id no:3：tggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacc。
10、seq id no:4：ggcccctccctcgggttaccccacagcctaggccgattcgacctctctccgctggggccctcgctggcgtccc tgcaccctgggagcgcgagcggcgcgcgggcggggaagcgcggcccagacccccgggtccgcccggagcagctgcgctgtcggggccaggccgggctcccagtggattcgcgggcacagacgcccaggaccgcgctccccacgtggcggagggactggggacccgggcacccgtcctgccccttcaccttccggctccgcctcctccgcgcggaccccgccccgtcccgaccccttccgggtttccggcccagccccttccgggccctcccagcccctccccttcctttccggggccccgccctctcctcgcggcgcgagtttccggcagcgctgcgtcctgctgcgcacgtgggaagccctggccccggccacccccgcg。
11、更进一步地，所述治疗基因为luc荧光蛋白基因或p53基因，所述luc荧光蛋白基因的碱基序列如seq id no:5所示，所述p53基因的碱基序列如seq id no:6所示。
12、seq id no:5：atggccgatgctaagaacattaagaagggccctgctcccttctaccctctggaggatggcaccgctggcgag cagctgcacaaggccatgaagaggtatgccctggtgcctggcaccattgccttcaccgatgcccacattgaggtggacatcacctatgccgagtacttcgagatgtctgtgcgcctggccgaggccatgaagaggtacggcctgaacaccaaccaccgcatcgtggtgtgctctgagaactctctgcagttcttcatgccagtgctgggcgccctgttcatcggagtggccgtggcccctgctaacgacatttacaacgagcgcgagctgctgaacagcatgggcatttctcagcctaccgtggtgttcgtgtctaagaagggcctgcagaagatcctgaacgtgcagaagaagctgcctatcatccagaagatcatcatcatggactctaagaccgactaccagggcttccagagcatgtacacattcgtgacatctcatctgcctcctggcttcaacgagtacgacttcgtgccagagtctttcgacagggacaaaaccattgccctgatcatgaacagctctgggtctaccggcctgcctaagggcgtggccctgcctcatcgcaccgcctgtgtgcgcttctctcacgcccgcgaccctattttcggcaaccagatcatccccgacaccgctattctgagcgtggtgccattccaccacggcttcggcatgttcaccaccctgggctacctgatttgcggctttcgggtggtgctgatgtaccgcttcgaggaggagctgttcctgcgcagcctgcaagactacaaaattcagtctgccctgctggtgccaaccctgttcagcttcttcgctaagagcaccctgatcgacaagtacgacctgtctaacctgcacgagattgcctctggcggcgccccactgtctaaggaggtgggcgaagccgtggccaagcgctttcatctgccaggcatccgccagggctacggcctgaccgagacaaccagcgccattctgattaccccagagggcgacgacaagcctggcgccgtgggcaaggtggtgccattcttcgaggccaaggtggtggacctggacaccggcaagaccctgggagtgaaccagcgcggcgagctgtgtgtgcgcggccctatgattatgtccggctacgtgaataaccctgaggccacaaacgccctgatcgacaaggacggctggctgcactctggcgacattgcctactgggacgaggacgagcacttcttcatcgtggaccgcctgaagtctctgatcaagtacaagggctaccaggtggccccagccgagctggagtctatcctgctgcagcaccctaacattttcgacgccggagtggccggcctgcccgacgacgatgccggcgagctgcctgccgccgtcgtcgtgctggaacacggcaagaccatgaccgagaaggagatcgtggactatgtggccagccaggtgacaaccgccaagaagctgcgcggcggagtggtgttcgtggacgaggtgcccaagggcctgaccggcaagctggacgcccgcaagatccgcgagatcctgatcaaggctaagaaaggcggcaagatcgccgtgtaataa。
13、seq id no:6：atggaggagccgcagtcagatcctagcgtcgagccccctctgagtcaggaaacattttcagacctatggaaac tacttcctgaaaacaacgttctgtcccccttgccgtcccaagcaatggatgatttgatgctgtccccggacgatattgaacaatggttcactgaagacccaggtccagatgaagctcccagaatgccagaggctgctccccccgtggcccctgcaccagcagctcctacaccggcggcccctgcaccagccccctcctggcccctgtcatcttctgtcccttcccagaaaacctaccagggcagctacggtttccgtctgggcttcttgcattctgggacagccaagtctgtgacttgcacgtactcccctgccctcaacaagatgttttgccaactggccaagacctgccctgtgcagctgtgggttgattccacacccccgcccggcacccgcgtccgcgccatggccatctacaagcagtcacagcacatgacggaggttgtgaggcgctgcccccaccatgagcgctgctcagatagcgatggtctggcccctcctcagcatcttatccgagtggaaggaaatttgcgtgtggagtatttggatgacagaaacacttttcgacatagtgtggtggtgccctatgagccgcctgaggttggctctgactgtaccaccatccactacaactacatgtgtaacagttcctgcatgggcggcatgaaccggaggcccatcctcaccatcatcacactggaagactccagtggtaatctactgggacggaacagctttgaggtgcgtgtttgtgcctgtcctgggagagaccggcgcacagaggaagagaatctccgcaagaaaggggagcctcaccacgagctgcccccagggagcactaagcgagcactgcccaacaacaccagctcctctccccagccaaagaagaaaccactggatggagaatatttcacccttcagatccgtgggcgtgagcgcttcgagatgttccgagagctgaatgaggccttggaactcaaggatgcccaggctgggaaggagccaggggggagcagggctcactccagccacctgaagtccaaaaagggtcagtctacctcccgccataaaaaactcatgttcaagacagaagggcctgactcagac。
14、重组腺相关病毒载体在作为体内靶向识别膀胱癌细胞进行基因治疗的递送载体上的应用。
15、综上所述，相比于现有技术，本发明具有如下优点及益效果：
16、1、本发明提出将plz4多肽嵌入aav载体衣壳蛋白，以增强对膀胱癌的特异性靶向和治疗稳定性，不仅充分利用了plz4多肽的膀胱癌细胞特异性结合能力，还通过aav载体的高效递送系统，提高了治疗分子的体内稳定性和靶向效率，克服了plz4与aav载体单独使用的技术难题，有望显著提升膀胱癌的治疗效果。
17、2、本发明基于aav基因治疗及特异性多肽的原理，设计了一个靶向感染膀胱癌并可特异性杀伤肿瘤细胞的重组aav基因治疗载体(plz4-aav)。通过在载体上搭建luc荧光蛋白或p53凋亡信号，从而实现膀胱肿瘤的识别与治疗。这种创新的基因治疗方法，有效识别了肿瘤细胞与正常细胞，增强了特异性及靶向性，具有临床转化价值。
1.一种用于靶向识别膀胱癌细胞的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体以重组腺相关病毒的衣壳蛋白作为基础载体，再将plz4肽精确插入到基础载体的第588个和第589个氨基酸之间，最终得到的重组腺相关病毒载体的氨基酸序列如seq idno:1所示。
2.如权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体由蛋白对应的碱基序列翻录得到，即先通过分子克隆技术，将plz4肽编码序列对应的碱基序列通过重组dna技术精确插入到基础载体对应氨基酸的碱基序列处，最终得到的重组腺相关病毒载体的碱基序列如seq id no:2所示。
3.如权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体的的碱基序列后端还依次连有sv40增强子、htert突变型启动子和治疗基因。
4.如权利要求3所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述sv40增强子、htert突变型启动子的碱基序列分别如seq id no:3、seq id no:4所示。
5.如权利要求3所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述治疗基因为luc荧光蛋白基因或p53基因，所述luc荧光蛋白基因的碱基序列如seq id no:5所示，所述p53基因的碱基序列如seq id no:6所示。
6.如权利要求1～5任意一项所述的重组腺相关病毒载体在作为体内靶向识别膀胱癌细胞进行基因治疗的递送载体上的应用。
