本发明属于生物酶工程，具体涉及一种应用尿嘧啶磷酸核糖转移酶合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，是一种以尿嘧啶磷酸核糖转移酶为催化剂，立体选择性地催化烟酰胺与5-磷酸核糖-1-焦磷酸缩合获得β-烟酰胺单核苷酸的方法。
背景技术：
1、β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide,nmn)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,nad,又称辅酶ⅰ)的前体物质，是细胞内一个重要的中间代谢产物。nad难以直接进入细胞，nmn作为合成nad的直接前体，耐受性良好，并能够防止与年龄相关的生理衰退(mills kf,yoshida s,stein lr,et al.long-termadministration of nicotinamide mononucleotide mitigates age-associatedphysiological decline in mice.cell metab.2016,24,795-806)，因此作为nad补充剂的首选物质。除此之外，nmn被证明通过逆转与衰老相关的线粒体功能障碍，在治疗高脂肪饮食诱导的2型糖尿病方面有效(haigis mc,mostoslavsky r,haigis km,et al.sirt4inhibits glutamate dehydrogenase and opposes the effects of calorierestriction in pancreatic beta cells.cell.2006,126,941-954)。但天然nmn在生物体内含量极低，无法通过分离提取获得。目前nmn传统制备方法是通过化学合成途径制备，但由于较难控制立体选择性，收率较低，且制备高纯度的nmn成本较高，以其为主要活性成分的产品十分昂贵。与化学合成比较，生物酶法合成nmn具有高效环保、无有机溶剂残留且不存在手性等问题的优势。目前催化nmn合成的烟酰胺磷酸核糖转移酶受到其分子量大、结构复杂、不易定向进化等因素的限制，可用于合成nmn的新型高效磷酸核糖转移酶仍亟待开发。
2、尿嘧啶磷酸核糖转移酶(uracil phosphoribosyltransferase,uprt)，属于磷酸核糖基转移酶(prtase)家族，目前报道的生物学功能为催化尿嘧啶与5-磷酸核糖-1-焦磷酸(prpp)缩合生成尿嘧啶核苷单磷酸(ump)，是嘧啶补救合成途径关键酶。
技术实现思路
1、本发明目的在于提供一种应用尿嘧啶磷酸核糖转移酶合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，是一种可用于合成nmn的新型磷酸核糖转移酶，是一种应用尿嘧啶磷酸核糖转移酶立体选择性催化烟酰胺(nam)与5-磷酸核糖-1-焦磷酸(prpp)缩合获得nmn的方法，是尿嘧啶磷酸核糖转移酶底物谱的扩展应用。该方法具有酶催化剂易制备、可操作性强、反应步骤简单、转化效率高等优势。
2、本发明提供的一种应用尿嘧啶磷酸核糖转移酶合成nmn的方法，以nam和prpp为底物，经酶催化体系催化获得nmn，所述酶催化体系由尿嘧啶磷酸核糖转移酶和prpp合成系统组成。
3、具体步骤为：以nam和prpp为原料，以mg2+为辅因子，通过酶催化体系中的尿嘧啶磷酸核糖转移酶的催化下，缩合获得nmn，反应式如下：
4、
5、在反应过程中nam与prpp作为底物，但由于prpp价格昂贵，且易分解，通过prpp合成系统合成prpp，可显著降低反应成本。
6、本发明中，所述prpp合成系统为：以核糖激酶和磷酸核糖焦磷酸激酶作为系统关键酶、以atp与d-核糖为底物、以mg2+作为辅因子的prpp合成系统。
7、本发明所述酶催化体系包括尿嘧啶磷酸核糖转移酶、核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸激酶和氯化镁。所述酶催化体系中尿嘧啶磷酸核糖转移酶、核糖激酶与磷酸核糖焦磷酸激酶纯化后均为游离纯酶。向该酶反应体系加入atp、d-核糖、nam与prpp，在控制ph和温度的条件下，mg2+作为辅因子，atp在核糖激酶的催化下将d-核糖磷酸化为5-磷酸核糖，进而在磷酸核糖焦磷酸激酶的催化下将5-磷酸核糖磷酸化为prpp，最后尿嘧啶磷酸核糖转移酶将nam与prpp缩合生成nmn，反应式如下：
8、
9、具体的，尿嘧啶磷酸核糖转移酶来源于大肠杆菌(escherichia coli)，编码该escherichia coli磷酸核糖转移酶的核苷酸序列来源于genbank，编号为x57104.1，经密码子优化后，如序列表中ecuprt-dna(seq.no.1)所示。
10、具体的，尿嘧啶磷酸核糖转移酶的氨基酸序列如序列表中ecuprt-aa(seq.no.2)所示。
11、如本领域技术人员所知，本发明的尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因的核苷酸序列也可以是编码序列表中ecuprt--aa(seq.no.2)所示的氨基酸序列的其他任何核苷酸序列。
12、任何对ecuprt--dna所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、确实或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与核苷酸具有90％以上的同源性，均属于本发明的保护范围。
13、任何对ecuprt--aa所示氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或替换一个或几个氨基酸且具有nmn合成活性的，仍属于本发明的保护范围。
14、对于尿嘧啶磷酸核糖转移酶，任何其他来源的同工酶具有nmn合成活性的，均属于本发明的保护范围。
15、具体的，所述核糖激酶序列来源于大肠杆菌(escherichia coli(strain k12))，编码该核糖激酶的核苷酸序列来源于genbank，编号：948260，如序列表中rbks-dna(seq.no.3)所示，由全基因合成获得。
16、具体的，核糖激酶的氨基酸序列如序列表中rbks-aa(seq.no.4)所示。
17、具体的，所述磷酸核糖焦磷酸激酶序列来源于结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)，编码该磷酸核糖焦磷酸激酶的核苷酸序列来源于genbank，编号：885993，如序列表中mtprs-dna(seq.no.5)所示，由全基因合成获得。
18、具体的，磷酸核糖焦磷酸激酶的氨基酸序列如序列表中mtprs-aa(seq.no.6)所示。
19、作为优选，催化体系中，所述核糖激酶的添加量为0.05-3.0mg/ml；磷酸核糖焦磷酸激酶的添加量为0.1-6.0mg/ml；尿嘧啶磷酸核糖转移酶的添加量为0.1-5.0mg/ml。
20、催化体系中，底物nam的添加量为1-60mm；prpp的添加量为1.5-90mm；辅因子mg2+的添加量为0.1-20mm。prpp合成体系中底物atp的添加量为1.0-30mm；d-核糖的添加量为0.5-10mm。
21、作为优选，酶催化体系中，反应温度为25-37℃，反应时间为2-20h；更优选，温度为30～37℃，时间为4-14h。
22、作为优选，控制反应的ph值为6～9，采用氢氧化钠来控制ph的下降，采用甲酸来控制ph的上升。
23、本发明的有益效果主要体现在：提供了一种以尿嘧啶磷酸核糖转移酶作为生物催化剂通过催化nam与prpp缩合获得nmn的方法，目前尚未见报道；本发明中所述的尿嘧啶磷酸核糖转移酶催化反应速度快，可在4h内达到反应平衡，且分子量小，易纯化，大肠杆菌异源表达量可达到10mg/l培养基，可用镍亲和层析一步纯化获得纯度95％以上的游离酶，同时在ph值接近中性、常温下进行反应，无需过渡金属及有机溶剂参与反应，因此具有催化反应速率高、异源表达量高、易于纯化等特点，同时也具备反应条件温和、环境友好等生物催化的优势，具有良好的工业化应用开发前景。
1.一种应用尿嘧啶磷酸核糖转移酶合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，以烟酰胺与5-磷酸核糖-1-焦磷酸为底物，经酶催化体系催化获得β-烟酰胺单核苷酸，所述酶催化体系由尿嘧啶磷酸核糖转移酶和prpp合成系统组成。
2.根据权利要求1所述的一种应用尿嘧啶磷酸核糖转移酶合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：以烟酰胺与5-磷酸核糖-1-焦磷酸为原料，以mg2+为辅因子，在酶催化体系中的尿嘧啶磷酸核糖转移酶的催化下，将底物进行缩合得到β-烟酰胺单核苷酸，反应式：
3.根据权利要求1或2所述的一种应用尿嘧啶磷酸核糖转移酶合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，尿嘧啶磷酸核糖转移酶来源于大肠杆菌(escherichia coli)，编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶的核苷酸序列如seq.no.1所示，其氨基酸序列如seq.no.2所示。
4.根据权利要求1或2所述的一种应用尿嘧啶磷酸核糖转移酶合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述prpp合成系统为：以核糖激酶和磷酸核糖焦磷酸激酶作为系统关键酶、以atp与d-核糖为底物、以mg2+作为辅因子，以mg2+作为辅因子，atp在核糖激酶的催化下将d-核糖磷酸化为5-磷酸核糖，进而在磷酸核糖焦磷酸激酶的催化下将5-磷酸核糖磷酸化为prpp，prpp作为尿嘧啶磷酸核糖转移酶的底物，与nam缩合生成nmn，反应式如下：
5.根据权利要求1或2所述的一种应用尿嘧啶磷酸核糖转移酶合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述酶催化体系包括尿嘧啶磷酸核糖转移酶、核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸激酶、底物和辅因子mg2+，所述酶催化体系中尿嘧啶磷酸核糖转移酶、核糖激酶及磷酸核糖焦磷酸激酶均纯化后为游离纯酶。
6.根据权利要求5所述的一种应用尿嘧啶磷酸核糖转移酶合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述核糖激酶来源于大肠杆菌(escherichia coli(strain k12))的核糖激酶。
7.根据权利要求5所述的一种应用尿嘧啶磷酸核糖转移酶合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述磷酸核糖焦磷酸激酶来源于结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)的磷酸核糖焦磷酸激酶。
8.根据权利要求1或2所述的一种应用尿嘧啶磷酸核糖转移酶合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，酶催化体系中，所述尿嘧啶磷酸核糖转移酶的添加量为0.1～5.0mg/ml，核糖激酶的添加量为0.05-3.0mg/ml，磷酸核糖焦磷酸激酶的添加量为0.1-6.0mg/ml。
9.根据权利要求1或2所述的一种应用尿嘧啶磷酸核糖转移酶合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，酶催化体系中，底物烟酰胺的添加量为1-60mm，与5-磷酸核糖-1-焦磷酸的添加量均为1.5-90mm；辅因子mg2+的添加量为0.1-20mm，prpp合成体系中底物atp的添加量为1.0-30mm；d-核糖的添加量为0.5-10mm，反应温度为25-37℃，反应时间为2-20h。
10.根据权利要求1或2所述的一种应用尿嘧啶磷酸核糖转移酶合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，控制反应的ph值为6～9。
