本发明属于生物，具体涉及一种杆状病毒-raav生产系统中转移载体paav-donor的制备方法及应用。
背景技术：
1、重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,raav)是基因治疗递送的明星载体，也是解析大脑结构与功能网络的重要工具。当前，包装aav最常用的方法包括贴壁或悬浮细胞/三质粒转染系统和昆虫细胞/杆状病毒生产系统。尽管通过三质粒瞬时转染贴壁的人胚肾(hek)293细胞可生产研究级的raav，不过这一工艺无法扩大。而悬浮hek293细胞/三质粒瞬时转染的方法虽然快捷、适用于所有的血清型、也可规模化发酵，但产量有限、空-全衣壳比率批次差异明显而且生产成本高昂。相比之下，基于杆状病毒的aav生产系统因其具有可扩展性、低成本和可预测的生物安全性而备受关注。
2、目前，利用杆状病毒大规模生产raav主要有三种方法：1)两杆状病毒系统；2)依赖包装细胞系的一杆状病毒系统；3)不依赖包装细胞系的基于穿梭质粒的一杆状病毒系统(onebac system)。然而该些制备工艺的周期均较长，需要耗费数周时间执行从转移载体构建、重组杆粒制备、转染、病毒扩增到下游分离纯化等流程。对于可灵活、高效生产不同种类raav的第3种方法而言，转移载体的构建是限速步骤也是难点，因为aav的cap基因、rep基因和itr核心表达元件需要被构建到一个转移载体上，欲获得不同血清型或含有不同核心表达元件的raav就必须重新制备对应的转移载体。
3、golden gate克隆技术是一种通过一步反应高效组装复杂载体的强大工具，这为解决上述限速步骤提供了可能。尽管利用该技术已经开发可简单、高效构建多基因表达载体的goldenbac系统，但与表达重组蛋白不同的是，aav各元件的编码要复杂的多：1)cap基因除了通过来自不同的起始密码子翻译三个衣壳亚基vp1、vp2和vp3外还编码组装活化蛋白maap、aap等，2)在杆状病毒aav制备系统中，rep基因编码病毒复制所需的两种蛋白rep78和rep52，且与rep52相比，rep78表达丰度较低有利于较高的载体产量，3)核心表达元件两端是用作病毒复制起点和包装信号的两个t形反向末端重复序列(itr)，itr容易缺失并影响病毒包装和感染，更不用说aav元件内部包含的iis型限制酶识别位点，因此该方法并不适用于one bac system中转移载体的构建。
技术实现思路
1、针对现有技术的以上缺陷，本发明提供一种杆状病毒-raav生产系统中转移载体paav-donor的制备方法及应用，其目的在于，通过将异源功能性基因表达元件置于aav-core骨架质粒、血清型cap基因置于aav-cap骨架质粒、rep基因置于aav-rep骨架质粒，从而根据需求一步golden gate自由组装上述三质粒，由此提高杆状病毒-raav生产系统中转移载体构建的便捷性、灵活性和高效性，进一步缩短利用杆状病毒生产raav的周期。
2、本发明的具体技术方案如下：
3、本发明提供一种杆状病毒-raav生产系统中转移载体paav-donor的制备方法，包括以下步骤：
4、(1)突变去除aav cap基因表达框中的iis型限制酶识别位点；
5、(2)修饰步骤(1)中获得的aav cap基因表达框：所述修饰的方式选自1)-4)中的一种或几种：1)在vp1 atg起始密码子5’端插入额外框外起始密码子；2)将vp1的atg起始密码子更换为次优翻译起始密码子、突变vp3亚基表达框外vp1表达框内的atg密码子；3)在aav衣壳编码序列的非atg翻译起始密码子与编码氨基酸残基的密码子之间插入一个或多个氨基酸残基的编码序列；4)插入内含子剪接受体序列调控vp1、vp2、vp3的相对表达；
6、修饰aav rep基因表达框：所述修饰的方式选自1)-2)中的一种：1)突变rep78起始密码子与rep52起始密码子之间所有的atg序列、更换rep78基因的起始密码子为非atg序列；2)插入内含子剪接受体序列弱化rep78蛋白的表达；
7、(3)分别制备aav-core、aav-cap和aav-rep骨架质粒；
8、所述aav-core骨架质粒属于golden gate组装供体质粒，包含两个相同类型的iis型限制性内切酶位点、两个aav-itr序列；
9、所述aav-cap骨架质粒属于golden gate组装供体质粒，包含两个与所述aav-core骨架质粒相同的iis型限制性内切酶位点、杆状病毒启动子、转录和转录后调控序列；
10、所述aav-rep骨架质粒属于golden gate组装受体质粒，包含两个与所述aav-cap骨架质粒相同的iis型限制性内切酶位点、杆状病毒启动子、转录和转录后调控序列、负筛选标记基因、tn7转座元件；
11、(4)将步骤(2)中获得的经修饰的cap基因表达框插入至步骤(3)aav-cap骨架质粒的多克隆位点中，将异源功能性基因表达元件插入至步骤(3)aav-core骨架质粒的多克隆位点中，将步骤(2)中获得的经修饰的aav rep基因表达框插入步骤(3)aav-rep骨架质粒的多克隆位点中，得到paav-rep、paav-cap和paav-core；
12、(5)将步骤(4)中获得的三个质粒通过golden gate克隆技术一步组装，转化stbl3感受态细胞，筛选阳性克隆，即可获得转移载体paav-donor。
13、进一步地，所述aav血清型选自aav1-13及其衍生血清型中一种或几种；
14、步骤(1)中突变去除的aav cap基因表达框中iis型限制酶识别位点包含bsai或eco31i(ggtctc 1/5)、bsmbi(cgtctc 1/5)、bbsi(gaagac 2/6)、sapi(gctcttc 1/4)的其中一个；
15、优选地，步骤(1)突变去除的aav cap基因表达框中iis型限制酶识别位点为bsai或eco31i(ggtctc)；
16、优选地，所述突变去除iis型限制酶识别位点为对iis型限制酶识别位点进行密码子同义替换或氨基酸同属性突变；
17、优选地，所述突变去除iis型限制酶识别位点包括vp3亚基表达框中密码子同义替换、vp1/vp2与maap/aap亚基重叠的表达框中氨基酸同属性突变、除了vp3/maap/aap亚基编码区外其余cap表达框中密码子同义替换。
18、进一步地，步骤(2)中所述修饰aav cap基因表达框的方式为将vp1的atg起始密码子更换为次优翻译起始密码子ctg且在ctg 5’端插入gccgcc序列，同时突变vp1起始密码子到vp3起始密码子之间的atg密码子；
19、优选地，步骤(2)中所述修饰aav rep基因表达框的方式为去除rep78起始密码子与rep52起始密码子之间所有的atg序列，并且rep78的atg翻译起始密码子更换为ctg同时在ctg 5’端插入gccgcc序列。
20、进一步地，步骤(3)所述iis型限制性内切酶包含bsai或eco31i(ggtctc 1/5)、bsmbi(cgtctc 1/5)、bbsi(gaagac 2/6)、sapi(gctcttc 1/4)的其中一个；
21、优选地，步骤(3)所述aav-core、aav-cap和aav-rep骨架质粒中的两个iis型限制性内切酶为bsai或eco31i(ggtctc 1/5)；
22、优选地，步骤(3)所述杆状病毒启动子来源于acmnpv或bmnpv，包含pp10、pph、pp6.9、pgp64、pie-1及其相互联合或启动子前添加增强子形成的组成型启动子；
23、优选地，步骤(3)所述aav-core骨架质粒中核心元件5’→3’为ggtctcatact-itr-mcs-itr-ccattgagacc；
24、优选地，步骤(3)所述aav-cap骨架质粒中核心元件5’→3’为ggtctcaagta-pp10-mcs-hsv tkpoly(a)-ctcctgagacc；
25、优选地，步骤(3)所述aav-cap骨架质粒中p10启动子选自acmnpv；
26、优选地，步骤(3)所述aav-rep骨架质粒中核心元件5’→3’为tn7r-gen-ggagtgagacc-ccdb-ggtctcaccat-pph-mcs-sv40 poly(a)-tn7l；
27、优选地，步骤(3)所述aav-rep骨架质粒中ph启动子优选自acmnpv；
28、优选地，步骤(3)所述aav-rep骨架质粒中负筛选标记基因包括但不限于ccdb、sacb。
29、进一步地，步骤(4)所述异源功能性基因表达元件中至少不含有与步骤(3)所述aav-core或aav-cap或aav-rep骨架质粒相同的iis型限制性内切酶位点；
30、优选地，步骤(4)所述异源功能性基因表达元件至少包含启动子、基因表达框、转录和转录后调控序列；
31、优选地，步骤(4)所述异源功能性基因表达元件中转录和转录后调控序列包括但不限于cw3sl、wpre、hghpolya、bgh polya。
32、进一步地，步骤(4)所述异源功能性基因表达元件、经修饰的cap基因表达框与经修饰的aav rep基因表达框均不含有iis型限制性内切酶识别位点；
33、优选地，步骤(4)所述异源功能性基因表达元件、经修饰的cap基因表达框与经修饰的aav rep基因表达框均不含有iis型限制性内切酶识别位点bsai或eco31i(ggtctc)。
34、进一步地，步骤(4)中经修饰的cap基因表达框插入至aav-cap骨架质粒的多克隆位点，异源功能性基因表达元件插入至aav-core骨架质粒的多克隆位点，经修饰的aav rep基因表达框插入aav-rep骨架质粒的多克隆位点采取同源重组克隆技术或酶切连接法。
35、进一步地，步骤(5)所述三个质粒golden gate组装条件为：1)质粒的组装需求量(ng)＝0.0345×paav-rep或paav-cap或paav-core的质粒大小，t4 dna ligase buffer(10×)2μl，golden gate enzyme mix 1μl，补充ddh2o至20μl；2)37℃(1h)→60℃(5min)→4℃(∞)；
36、优选地，步骤(5)所述转化stbl3感受态细胞的剂量为5μl。
37、本发明还提供上述制备方法得到的杆状病毒-raav生产系统中转移载体paav-donor。
38、本发明还提供所述制备方法或所述杆状病毒-raav生产系统中转移载体paav-donor在生产raav中的应用。
39、本发明进一步提供一种生产raav的方法，包括以下步骤：
40、通过bac-to-bac系统，将转移载体paav-donor转座至杆状病毒基因组中，获得重组杆粒；
41、提取相应的重组杆粒，并转染宿主细胞拯救出重组杆状病毒bev(p1代)；
42、将获得的p1代重组杆状病毒bev经连续传代后感染宿主或宿主细胞系，感染一定时间后，收获细胞纯化即得到raav；
43、优选地，所述杆状病毒基因组为acmnpv、bmnpv或apnpv；
44、优选地，所述宿主细胞来源于昆虫的卵巢、精巢、胚胎、成虫盘、中肠、脂肪体或血细胞；
45、优选地，所述bac-to-bac系统为苜蓿银纹夜蛾杆状病毒(acmnpv)表达系统；
46、优选地，所述宿主细胞为expi-sf9。
47、本发明的有益效果：
48、(1)本发明提供的paav-donor制备方法，通过将aav包装所需的异源功能性基因表达元件、血清型cap基因、rep基因分别负载于3个质粒上，从而根据raav的生产需求可以一步golden gate自由组装上述三质粒，实现杆状病毒-raav生产系统中转移载体的便捷、灵活、高效构建，即对于制备携带不同异源功能性基因片段的不同血清型raav，只需要在aav-cap质粒库、aav-core质粒库中选择恰当的质粒与aav-rep质粒golden gate组装即可，无需多次重复依赖限制性核酸内切酶、dna连接酶或同源重组酶作用将cap基因、rep基因和itr核心表达元件连接在pfbd(pfastbac dual)载体上；
49、(2)本发明基于raav-donor制备的便捷性、灵活性、高效性，可大幅缩短利用杆状病毒生产raav的周期；
50、(3)本发明可兼容现有的杆状病毒-raav生产系统。
1.一种杆状病毒-raav生产系统中转移载体paav-donor的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述aav血清型选自aav1-13及其衍生血清型中一种或几种；
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述修饰aav cap基因表达框的方式为将vp1的atg起始密码子更换为次优翻译起始密码子ctg且在ctg 5’端插入gccgcc序列，同时突变vp1起始密码子到vp3起始密码子之间的atg密码子；
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述iis型限制性内切酶包含bsai或eco31i(ggtctc 1/5)、bsmbi(cgtctc 1/5)、bbsi(gaagac 2/6)、sapi(gctcttc 1/4)的其中一个；
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述异源功能性基因表达元件中至少不含有与步骤(3)所述aav-core或aav-cap或aav-rep骨架质粒相同的iis型限制性内切酶位点；
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述三个质粒golden gate组装条件为：1)质粒的组装需求量(ng)＝0.0345×paav-rep或paav-cap或paav-core的质粒大小，t4 dna ligase buffer(10×)2μl，golden gate enzyme mix 1μl，补充ddh2o至20μl；2)37℃(1h)→60℃(5min)→4℃(∞)；
7.权利要求1-6任一项所述制备方法得到的杆状病毒-raav生产系统中转移载体paav-donor。
8.权利要求7所述杆状病毒-raav生产系统中转移载体paav-donor在生产raav中的应用。
9.一种生产raav的方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述杆状病毒基因组为acmnpv、bmnpv或apnpv；
