本发明涉及调控杨树木材形成的油菜素内酯的转录因子及其应用，尤其涉及一种调控杨树木材形成的油菜素内酯转录因子pagbrrf1及其应用，属于生物基因工程。
背景技术：
1、木材是生产、生活中必须的可再生资源。杨树是一种在全球广泛分布的经济树种，具有早期速生、适应性强、分布广、品种多、易杂交、易改良遗传性、易繁殖等特点，因而广泛用于集约栽培。杨树的用途很广，不仅用于加工业用材，而且是胶合板、纤维板、造纸、卫生筷和包装业的重要原材料。不仅有巨大的经济效益，而且有很大的生态效益和社会效益。因此，急需发展木材产量增加、木质素含量降低的优质高产杨树新品种。杨树是研究木材形成、多年生植物季节变化规律、生长发育、开花、性别决定以及生物互作的模式植物。因此，利用分子生物学和基因工程技术，提高杨树木材产量和改良杨树木材品质，具有重要理论意义和应用价值。
2、木材(wood)是林学中的常用名词，它的内涵与植物学中的次生木质部(secondaryxylem)基本一致，通常指木本植物的次生木质部。木质部细胞是维管形成层活动的产物，木材的形成和分化始于维管形成层的活动。因此木材的产量和品质取决于形成层干细胞的分裂与分化活性。杨树形成层的分裂活性和木质部分化活性受到油菜素内酯信号的调控。油菜素内酯(brassinosteroids)是植物中存在的一类植物甾醇类激素。油菜素内酯在植物生长和发育中起着重要作用，调节多种细胞发育过程。研究表明油菜素内酯含量的增加，可以显著提高植物生物量，并且油菜素内酯参与调控植物维管形成层的干细胞的维持与分化过程，促进次生木质部的分化与木材的形成。
3、研究表明，油菜素内酯信号在细胞内的传导通过诱导表达不同的转录因子，来进一步激活下游响应基因的表达，来进一步调控细胞的发育过程。我们前期研究表明，brrf1在木本植物杨树的维管形成层中特异响应油菜素内酯信号，深入研究brrf1基因在木材形成中的作用，进一步揭示油菜素内酯调控木材形成的分子机制，为林木育种提供新的途径。
4、因此，提供一种调控杨树木材形成的油菜素内酯转录因子pagbrrf1及其应用，利用木本植物为研究对象，结合分子生物学和基因工程技术，解析油菜素内酯调控杨树木材发育的分子机制，对于了解木本植物木材发育的分子基础以及通过分子育种改良林木、加快林木繁育，具有重要意义。
技术实现思路
1、本发明的目的之一是，针对现有技术中存在的不足，提供一种调控杨树木材形成的油菜素内酯转录因子pagbrrf1。
2、为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
3、一种调控杨树木材形成的油菜素内酯转录因子，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示。
4、本发明的另一目的是提供上述调控杨树木材形成的油菜素内酯转录因子的表达蛋白。
5、本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
6、一种调控杨树木材形成的油菜素内酯转录因子，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。
7、本发明的另一目的是提供上述调控杨树木材形成的油菜素内酯转录因子的植物表达载体。
8、一种含有调控杨树木材形成的油菜素内酯转录因子的植物表达载体，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。
9、本发明的另一目的是提供一种含有调控杨树木材形成的油菜素内酯转录因子的植物表达载体的构建方法。
10、本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
11、一种含有调控杨树木材形成的油菜素内酯转录因子的植物表达载体的构建方法，其步骤如下：
12、(1)克隆pagbrrf1基因
13、以84k银腺杨为材料，使用rneasy plant mini试剂盒和rnase-free dnase i试剂盒提取组培苗84k的总rna；通过使用superscript iii first-strand synthesis system合成cdna第一链；参考已发表毛果杨基因组序列，使用primer3软件设计引物，pagbrrf1cds正向引物和pagbrrf1 cds反向引物，进行基因全长扩增；
14、(2)pagbrrf1基因植物表达载体构建
15、利用克隆技术构建pagbrrf1基因的过量表达载体，使用primer3软件设计载体特异pcr引物，pagbrrf1载体正向引物和pagbrrf1载体反向引物，以pagbrrf1为模板，进行pcr扩增；
16、将pagbrrf1基因的cds构建到目标载体，目标载体为pcambia1300(seq入门载体pcambia1300：10177 bp)；
17、(3)目标载体用hindiii酶进行酶切；
18、(4)通过同源重组反应将两端带有载体特异性引物的目标基因构建至植物表达载体pcambia1300；
19、(5)最终构建完成的载体为pcambia-pagbrrf1。
20、优选地，步骤(1)中，pagbrrf1 cds正向引物如序列表中序列4所示，pagbrrf1 cds反向引物如序列表中序列5所示；高保真pcr反应体系如下：takara高保真扩增酶primestar7.5μl，正向引物(10μm)0.15μl，反向引物(10μm)0.15μl，模板(84k杨cdna)0.8μl，无菌ddh2o补足至15μl，反应程序：98℃，1min；(98℃，10s；56℃，15s；72℃，1min)35个循环；72℃，3min。
21、优选地，步骤(2)中，pagbrrf1载体特异正向引物如序列表中序列6所示，pagbrrf1载体特异反向引物如序列表中序列7所示。
22、优选地，步骤(3)中，酶切体系如下：5ng的目标载体pcambia1300；hindiii酶3μl；10x green buffer 3μl；ddh2o补足至30μl；反应体系：37℃，30min。
23、优选地，步骤(4)中，同源重组反应体系：经过hindiii酶切过的pcambia130080ng；同源重组酶用量3.75μl；ddh2o补足至10μl；反应体系：45℃，30min；步骤(5)中，在pagbrrf1基因的5’端具有组成型强表达启动子p35s；在pagbrrf1基因的3’端组装有强终止子nos；确认过量表达载体为pcambia-pagbrrf1。
24、本发明的另一目的是提供一种调控杨树木材形成的油菜素内酯转录因子brrf1的遗传转化。
25、本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
26、一种调控杨树木材形成的油菜素内酯转录因子brrf1的遗传转化，其步骤如下：通过冷激法，将所构建的pc1300-pagbrrf1过量表达载体转入农杆菌eha105中，通过农杆菌介导的叶盘转化法，将pagbrrf1基因转入84k杨树。
27、本发明的另一目的是提供一种调控杨树木材形成的油菜素内酯转录因子brrf1的应用。
28、本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
29、杨树油菜素内酯转录因子brrf1在调控杨树生长发育过程中的应用。
30、本发明的优点：
31、本发明以84k银腺杨为材料，克隆了pagbrrf1基因；同时，构建过量表达载体pc1300-pagbrrf1，该基因位于组成型启动子35s之后，在组成型启动子35s的驱动下，pagbrrf1可在杨树体内高效表达，从而加速杨树木材的形成过程。
32、与现有技术相比，本发明通过将pagbrrf1基因转入杨树，过量表达pagbrrf1的转基因杨树与野生型比较，植株高度明显增加，直径也增加，且木质部细胞数量明显增多，说明pagbrrf1基因是调控杨树木材的形成的关键调节基因，在林木基因工程领域和无性系林业领域有重要应用价值。
33、下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护的范围的限制。
1.一种调控杨树木材形成的油菜素内酯转录因子，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中序列1所示。
2.权利要求1所述调控杨树木材形成的油菜素内酯转录因子的表达蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如序列表中序列2所示。
3.一种含有调控杨树木材形成的油菜素内酯转录因子的植物表达载体，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中序列3所示。
4.权利要求3所述含有调控杨树木材形成的油菜素内酯转录因子的植物表达载体的构建方法，其步骤如下：
5.根据权利要求4所述含有调控杨树木材形成的油菜素内酯转录因子的植物表达载体的构建方法，其特征在于：步骤(1)中，pagbrrf1 cds正向引物如序列表中序列4所示，pagbrrf1 cds反向引物如序列表中序列5所示；高保真pcr反应体系如下：takara高保真扩增酶primestar 7.5μl，10μm的正向引物0.15μl，10μm的反向引物0.15μl，模板84k杨cdna0.8μl，无菌ddh2o补足至15μl，反应程序：98℃，1min；98℃，10s；56℃，15s；72℃，1min：35个循环；72℃，3min。
6.根据权利要求5所述含有调控杨树木材形成的油菜素内酯转录因子的植物表达载体的构建方法，其特征在于：步骤(2)中，pagbrrf1载体特异正向引物如序列表中序列6所示，pagbrrf1载体特异反向引物如序列表中序列7所示。
7.根据权利要求6所述含有调控杨树木材形成的油菜素内酯转录因子的植物表达载体的构建方法，其特征在于：步骤(3)中，酶切体系如下：5ng的目标载体pcambia1300；hindiii酶3μl；10x green buffer 3μl；ddh2o补足至30μl；反应体系：37℃，30min。
8.根据权利要求7所述含有调控杨树木材形成的油菜素内酯转录因子的植物表达载体的构建方法，其特征在于：步骤(4)中，同源重组反应体系：经过hindiii酶切过的pcambia1300 80ng；同源重组酶用量3.75μl；ddh2o补足至10μl；反应体系：45℃，30min；步骤(5)中，在pagbrrf1基因的5’端具有组成型强表达启动子p35s；在pagbrrf1基因的3’端组装有强终止子nos；确认过量表达载体为pcambia-pagbrrf1。
9.权利要求1所述调控杨树木材形成的油菜素内酯转录因子的遗传转化，其步骤如下：通过冷激法，将pc1300-pagbrrf1过量表达载体转入农杆菌eha105中，通过农杆菌介导的叶盘转化法，将pagbrrf1基因转入84k杨树。
10.权利要求1所述调控杨树木材形成的油菜素内酯转录因子在调控杨树生长发育过程中的应用。
