本发明属于生物医药领域，涉及一种具有抗弧菌、抗氧化活性的ph响应性壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸锌复合物的制备方法。
背景技术：
1、天然柠檬醛的构型主要有α-柠檬醛(橙花醛)和β-柠檬醛(香叶醛)两种，其来源主要是枫茅油和山苍子油等。山苍子是我国特有的一种林源香料植物，资源丰富，其挥发油中天然柠檬醛的含量可高达70％以上。因此，开发利用天然柠檬醛对于提高山苍子的资源利用率和附加值具有重要意义。柠檬醛在食品、日化、医药等领域有着广泛的应用前景，具有增香、抗菌和信息素等多种功能。但是，柠檬醛易挥发，且化学性质活泼，容易发生氧化还原反应生成香叶酸或香叶醇/橙花醇等物质。因此，提高柠檬醛的稳定性是其应用的关键问题。
2、壳聚糖(cts)是一种阳离子碱性氨基多糖，具有良好的生物相容性、无毒性、无抗原性和可生物降解性，是一种理想的药物载体材料。壳聚糖还具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性。壳聚糖上的氨基可与柠檬醛上的醛基发生席夫碱反应，形成壳聚糖-柠檬醛交联物；对香豆酸是一种常见的植物酚类化合物，具有良好的抗氧化性和抗菌性。壳聚糖上的氨基、羟基以及对香豆酸上的羧基、羟基可与多种金属离子(如ca、zn、fe、cu等)形成络合物，形成有机金属盐。锌盐是一类常用的食品和饲料添加剂，如乙酸锌、硫酸锌、柠檬酸锌、碱式氯化锌、甘氨酸锌等，具有防腐、保鲜、稳定等作用，也是一种有效的锌营养强化剂。超临界流体(常用二氧化碳)具有溶解其他物质的特殊能力，除了用于提取分离外，还可应用于超临界条件化学反应，具有反应效率高，反应温度低、隔氧，溶剂环保等优点。本发明以壳聚糖、柠檬醛、对香豆酸和锌盐为主要原料，利用席夫碱反应和络合反应，在超临界二氧化碳条件下制备了一种具有ph响应性的壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸锌复合物，该复合物具有抗弧菌和抗氧化活性，可有效提高柠檬醛的稳定性和功能性。
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术的缺点，本发明提出了利用壳聚糖、柠檬醛、对香豆酸和锌盐为原料，在超临界二氧化碳条件下制备一种壳聚糖复合物，增加壳聚糖的抗菌、抗氧化活性基团。所制备的壳聚糖复合物具有优异的抗弧菌、抗氧化以及ph响应性功能。
2、为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
3、一种具有抗弧菌、抗氧化活性的ph响应性壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸锌复合物的制备方法，包括将壳聚糖-柠檬醛分散液滴加到对香豆酸锌溶液中，加热搅拌均匀，待体系稳定后，在超临界二氧化碳条件下进行反应，待体系生成稳定的黄色或深黄色沉淀，用大量溶剂洗涤若干次，经干燥后，即得到壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸锌复合物。
4、进一步地，所述壳聚糖-柠檬醛分散液的质量分数为0.5-17.5wt.％；壳聚糖-柠檬醛分散液的制备方法为：将0.5-25wt.％柠檬醛溶液缓慢滴加到0.5wt.％-10wt.％的壳聚糖分散液中，在40-60℃的加热条件下，搅拌均匀并待体系稳定后，在30-60℃、10-30mpa的条件下，通过超临界二氧化碳条件下反应10-60min，待体系变为稳定的淡黄色或黄色即得到壳聚糖-柠檬醛分散液；其中，柠檬醛溶液所用的溶剂为乙醇或乙酸乙酯或丙酮；壳聚糖分散液所用的溶剂为乙醇或乙酸乙酯或丙酮。
5、进一步地，所述壳聚糖-柠檬醛分散液的质量分数为10wt.％；壳聚糖-柠檬醛分散液的制备方法为：将15wt.％柠檬醛乙醇溶液缓慢滴加到5wt.％的壳聚糖乙醇分散液中，在50℃的加热条件下，搅拌均匀并待体系稳定后，在45℃、25mpa的条件下，通过超临界二氧化碳条件下反应40min，待体系变为稳定的淡黄色或黄色即得到10wt.％壳聚糖-柠檬醛分散液。
6、进一步地，所述对香豆酸锌溶液的质量分数为0.5-25wt.％；对香豆酸锌溶液的制备方法为：将0.5-25wt.％的对香豆酸溶液缓慢滴加到0.5-25wt.％的锌盐溶液中，并在30-60℃加热条件下搅拌反应0.5-3h，反应完毕后在溶液中加入2-15倍体积量的甲醇或乙醇溶液产生沉淀，去除沉淀，溶液进一步浓缩得到一定浓度对香豆酸锌溶液；其中，对香豆酸溶液所用溶剂的种类为乙醇或乙酸乙酯或丙酮；锌盐的种类为氯化锌或碱式氯化锌或硫酸锌或乙酸锌或柠檬酸锌或乳酸锌或葡萄糖酸锌。
7、进一步地，所述对香豆酸锌溶液的质量分数为10wt.％；对香豆酸锌溶液的制备方法为：将含有10wt.％对香豆酸乙醇溶液缓慢滴加到含有10wt.％的硫酸锌溶液中，在45℃加热条件下搅拌反应1h，反应完毕后在溶液中加入10倍体积量的乙醇溶液产生沉淀，去除沉淀，溶液进一步浓缩得到一定浓度对香豆酸锌溶液。
8、进一步地，所述加热搅拌的温度为40-60℃；所述在超临界二氧化碳条件下进行反应的温度为30-60℃、压力为10-30mpa；反应时间为10-60min；所述溶剂为乙醇或乙酸乙酯或丙酮。
9、进一步地，所述加热搅拌的温度为50℃；所述在超临界二氧化碳条件下进行反应的温度为45℃、压力为25mpa；反应时间为40min；所述溶剂为乙醇。
10、进一步地，所述的具有抗弧菌、抗氧化活性的ph响应性壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸锌复合物的制备方法，步骤如下：
11、(1)先将15wt.％柠檬醛乙醇溶液滴加到5wt.％壳聚糖乙醇分散液中，在50℃的加热条件下，搅拌均匀并待体系稳定后，在温度为45℃、压力为25mpa的条件下，通过超临界二氧化碳条件下反应40min，待体系变为稳定的淡黄色或黄色即得到10wt.％壳聚糖-柠檬醛分散液；
12、(2)再将含有10wt.％对香豆酸乙醇溶液缓慢滴加到含有10wt.％的硫酸锌溶液中，在45℃加热条件下搅拌反应1h，反应完毕后在溶液中加入10倍体积量乙醇溶液产生沉淀，去除沉淀，溶液进一步浓缩得到一定浓度对香豆酸锌溶液；
13、(3)最后，将步骤(1)所得的10wt.％的壳聚糖-柠檬醛分散液缓慢滴加到步骤(2)所得的10wt.％的对香豆酸锌中，在50℃加热条件下，搅拌均匀并待体系稳定后，在温度为45℃、压力为25mpa的条件下，条件下，通过超临界二氧化碳条件下反应40min，待体系颜色加深生成稳定的黄色或深黄色沉淀，随后将该沉淀用大量乙醇洗涤数次，经干燥后得到壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸锌复合物。
14、进一步地，由所述的方法制备得到的具有抗弧菌、抗氧化活性的ph响应性壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸锌复合物，该壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸锌复合物在水中分散性良好，粒径分布范围为650～1054nm，分布系数0.301；稳定性良好，常温自然放置三个月内无色变、无团聚、无变质现象；在酸性环境下，具有良好的ph响应性和锌离子稳定释放性。
15、进一步地，所述的壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸锌复合物在抗弧菌、抗氧化活性领域中的应用，壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸锌复合物对副溶血性弧菌具有明显的抑制作用，最低抑菌浓度为128μg/ml；具有良好的抗氧化活性，半数清除浓度分别为676.8μg/ml(dpph方法)。
16、相比于现有技术，本技术的优点：
17、(1)本发明以壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸和锌盐为主要原料，利用席夫碱反应和络合反应，在超临界条件下制备了一种壳聚糖-柠檬醛-钙盐复合物，粒径分布范围为650～1054nm，分布系数0.301。
18、(2)本发明制成的复合物稳定性好，水分散性好，生物活性作用明显。该剂型既能满足科研相关生物活性实验要求，又可添加至固体、流体、半流体以及水含量较高的其他相关制剂或产品中，应用范围广。
19、(3)本发明所用主要原材料符合中国食品添加剂原料要求，所用溶剂均为低毒溶剂，制备方法简单，工艺稳定性好，可以应用于食品、医药等领域。
20、(4)本发明制成的复合物具有良好的ph响应性、抗弧菌活性和抗氧化活性，可开发成食品或饲料添加剂、抗菌剂等；且本复合物具有丰富的锌含量，也可以作为动物锌营养补充剂应用。
1.一种具有抗弧菌、抗氧化活性的ph响应性壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸锌复合物的制备方法，其特征在于，将壳聚糖-柠檬醛分散液滴加到对香豆酸锌溶液中，加热搅拌均匀，待体系稳定后，在超临界二氧化碳条件下进行反应，待体系生成稳定的黄色或深黄色沉淀，用溶剂洗涤若干次，经干燥后，即得到壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸锌复合物。
2.根据权利要求1所述的具有抗弧菌、抗氧化活性的ph响应性壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸锌复合物的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖-柠檬醛分散液的质量分数为0.5-17.5wt.％；壳聚糖-柠檬醛分散液的制备方法为：将0.5-25wt.％柠檬醛溶液缓慢滴加到0.5wt.％-10wt.％的壳聚糖分散液中，在40-60℃的加热条件下，搅拌均匀并待体系稳定后，在30-60℃、10-30mpa的条件下，通过超临界二氧化碳条件下反应10-60min，待体系变为稳定的淡黄色或黄色即得到壳聚糖-柠檬醛分散液；其中，柠檬醛溶液所用的溶剂为乙醇或乙酸乙酯或丙酮；壳聚糖分散液所用的溶剂为乙醇或乙酸乙酯或丙酮。
3.根据权利要求2所述的具有抗弧菌、抗氧化活性的ph响应性壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸锌复合物的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖-柠檬醛分散液的质量分数为10wt.％；壳聚糖-柠檬醛分散液的制备方法为：将15wt.％柠檬醛乙醇溶液缓慢滴加到5wt.％的壳聚糖乙醇分散液中，在50℃的加热条件下，搅拌均匀并待体系稳定后，在45℃、25mpa的条件下，通过超临界二氧化碳条件下反应40min，待体系变为稳定的淡黄色或黄色即得到壳聚糖-柠檬醛分散液。
4.根据权利要求1所述的具有抗弧菌、抗氧化活性的ph响应性壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸锌复合物的制备方法，其特征在于，所述对香豆酸锌溶液的质量分数为0.5-25wt.％；对香豆酸锌溶液的制备方法为：将0.5-25wt.％的对香豆酸溶液缓慢滴加到0.5-25wt.％的锌盐溶液中，并在30-60℃加热条件下搅拌反应0.5-3h，反应完毕后在溶液中加入2-15倍体积量的甲醇或乙醇溶液产生沉淀，去除沉淀，溶液进一步浓缩得到一定浓度对香豆酸锌溶液；其中，对香豆酸溶液所用溶剂的种类为乙醇或乙酸乙酯或丙酮；锌盐的种类为氯化锌或碱式氯化锌或硫酸锌或乙酸锌或柠檬酸锌或乳酸锌或葡萄糖酸锌。
5.根据权利要求4所述的具有抗弧菌、抗氧化活性的ph响应性壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸锌复合物的制备方法，其特征在于，所述对香豆酸锌溶液的质量分数为10wt.％；对香豆酸锌溶液的制备方法为：将含有10wt.％对香豆酸乙醇溶液缓慢滴加到含有10wt.％的硫酸锌溶液中，在45℃加热条件下搅拌反应1h，反应完毕后浓缩至干，随后加入10倍体积量乙醇溶液产生沉淀，去除沉淀，溶液进一步浓缩得到一定浓度对香豆酸锌溶液。
6.根据权利要求1所述的具有抗弧菌、抗氧化活性的ph响应性壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸锌复合物的制备方法，其特征在于，所述加热搅拌的温度为40-60℃；所述在超临界二氧化碳条件下进行反应的温度为30-60℃、压力为10-30mpa；反应时间为10-60min；所述溶剂为乙醇或乙酸乙酯或丙酮。
7.根据权利要求6所述的具有抗弧菌、抗氧化活性的ph响应性壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸锌复合物的制备方法，其特征在于，所述加热搅拌的温度为50℃；所述在超临界二氧化碳条件下进行反应的温度为45℃、压力为25mpa；反应时间为40min；所述溶剂为乙醇。
8.根据权利要求1-7任一所述的具有抗弧菌、抗氧化活性的ph响应性壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸锌复合物的制备方法，其特征在于，步骤如下：
9.根据权利要求1-8任一所述的方法制备得到的具有抗弧菌、抗氧化活性的ph响应性壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸锌复合物，其特征在于，壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸锌复合物在水中分散性良好，粒径分布范围为650～1054nm，分布系数0.301；稳定性良好，常温自然放置三个月内无色变、无团聚、无变质现象；在酸性环境下，具有良好的ph响应性和锌离子稳定释放性。
10.根据权利要求9所述的壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸锌复合物在抗弧菌、抗氧化活性领域中的应用，其特征在于，壳聚糖-柠檬醛-对香豆酸锌复合物对副溶血性弧菌具有明显的抑制作用，最低抑菌浓度为128μg/ml；具有良好的抗氧化活性，半数清除浓度分别为676.8μg/ml(dpph方法)。
