本发明涉及基因工程以及微生物工程。更具体地，涉及一种高效合成丁烯基多杀菌素的须糖多孢菌工程菌株及其构建方法和应用。
背景技术：
1、过度使用化学杀虫剂容易带来环境污染、害虫耐药性等多种问题。来源于自然环境、生产简单且具有较强杀虫活性的生物杀虫剂，可以弥补化学杀虫剂的不足。微生物次级代谢产物是绿色杀虫剂的主要来源之一，其结构繁多、杀虫机制复杂且专一性较强，因此是一种极具有开发潜力的生物杀虫剂。多杀霉素是当前应用较为广泛的一种生物杀虫剂。丁烯基多杀菌素是多杀霉素的一种结构类似物，但是比多杀霉素具有更广谱的杀虫活性，同时也具有更长的持效期，是一种更环保、高效的杀虫剂。因为其化学合成困难，微生物合成又不能够满足当前工业生产的需求，因此尚未得到开发应用。
2、微生物次级代谢产物的合成往往和环境变化、形态发育相关，多会受到复杂的调控网络的控制。通过调控链霉菌的代谢调控网络，如正调控子过表达、负调控子失活、中间代谢物平衡等，都可以促进天然产物的合成。氧化还原反应是生命所必需的，黄素和烟酰胺是非常经典的氧化还原辅因子，除此以外，还进化出了很多niche辅因子。这种辅因子来源于核糖体合成和翻译后修饰肽(ripps)，例如吡咯喹啉醌(pyroroloquinoline quinone,pqq)和分枝杆菌素(mycofactsin,mft)。当前的研究进展表明，mft对维持细胞内nad+/nadh稳态，细胞在无氧条件下生存具有重要意义。位于mft生物合成基因簇附近的转录调控因子mftr，可在长链酰基辅酶a的诱导作用下，调控mft的合成，因此推测mft可能对脂肪酸代谢至关重要。其次，mftr作为tetr家族转录调控因子，在抗生素生物合成、三羧酸循环、生物膜形成和群体感应方面发挥着重要作用。但目前没有关于转录调控因子mftr是否能提高烯基多杀菌素产量的报道。
技术实现思路
1、本发明的一个目的在于提供一种须糖多孢菌工程菌株，以高效合成丁烯基多杀菌素。
2、本发明的另一个目的在于提供上述须糖多孢菌工程菌株的构建方法和应用。
3、为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
4、本发明首先提供了如下1)或2)任一应用：
5、1)perme*启动子在提高tetr家族转录调控因子mftr基因表达量的应用。
6、2)过表达tetr家族转录调控因子mftr基因在提高丁烯基多杀菌素产量中的应用。
7、本发明进一步提供了一种高效合成丁烯基多杀菌素的须糖多孢菌工程菌株，所述须糖多孢菌工程菌株是以须糖多孢菌为出发菌过表达tetr家族转录调控因子mftr基因所得。
8、进一步，所述过表达tetr家族转录调控因子mftr基因是利用perme*启动子过表达tetr家族转录调控因子mftr基因。
9、进一步，所述tetr家族转录调控因子mftr基因为如下任一所述的核苷酸序列：
10、a1)seq id no.1所示的核苷酸序列；
11、b1)上述a1)的互补序列；
12、c1)由于遗传密码简并性而从seq id no.1的核苷酸序列衍生的多核苷酸。
13、进一步，所述tetr家族转录调控因子mftr基因编码得到的氨基酸序列如seq idno.2所示。
14、进一步，所述perme*启动子的核苷酸序列如seq id no.3所示。
15、进一步，所述以须糖多孢菌为出发菌利用perme*启动子过表达tetr家族转录调控因子mftr基因是在须糖多孢菌中导入含有perme*启动子和连接在所述perme*启动子后的tetr家族转录调控因子mftr基因的基因表达框的质粒。
16、在本发明具体的实施方式中，所述含有perme*启动子和连接在所述perme*启动子后的tetr家族转录调控因子mftr基因的基因表达框的质粒为重组质粒pset159-perme*-mftr，所述重组质粒pset159-perme*-mftr是将所述perme*启动子和tetr家族转录调控因子mftr基因与质粒pset159进行组装得到的。
17、进一步，所述质粒pset159是以商用质粒pset152为基础，以噬菌体r4整合酶位点替换质粒pset152质粒上的φc31整合酶位点所获得的。
18、在本发明具体的实施方式中，所述重组质粒pset159-perme*-mftr的构建方法为：从须糖多孢菌的基因组中pcr扩增得到含tetr家族转录调控因子mftr基因片段，从质粒pset159中pcr扩增得到pset159的骨架片段，从pset152-perme*中pcr扩增得到perme*启动子的基因片段，利用gibson组装试剂盒(neb,货号为e2611l)将perme*启动子的基因片段、含tetr家族转录调控因子mftr基因片段和pset159的骨架片段进行组装，得到重组质粒pset159-perme*-mftr。
19、本发明perme*启动子和连接在所述perme*启动子后的tetr家族转录调控因子mftr基因的基因表达框和含有所述基因表达框的质粒及其在提高丁烯基多杀菌素产量中的应用也在本发明的保护范围之内。
20、本发明进一步提供须糖多孢菌工程菌株的构建方法，包括如下步骤：将含有perme*启动子和连接在所述perme*启动子后的tetr家族转录调控因子mftr基因的基因表达框的质粒转化到须糖多孢菌中，获得须糖多孢菌工程菌株。
21、在本发明具体的实施方式中，所述构建方法，包括如下步骤：
22、(1)构建重组质粒pset159-perme*-mftr：从须糖多孢菌的基因组中pcr扩增得到含tetr家族转录调控因子mftr基因片段，从质粒pset159中pcr扩增得到pset159的骨架片段，从pset152-perme*中pcr扩增得到perme*启动子的基因片段，采用gibson组装方式将perme*启动子的基因片段、含tetr家族转录调控因子mftr基因片段、pset159的骨架片段进行组装，得到重组质粒pset159-perme*-mftr；
23、(2)转化重组质粒pset159-perme*-mftr：采用接合转移将重组质粒pset159-perme*-mftr转化到须糖多孢菌中，获得须糖多孢菌工程菌株。
24、进一步，所述pcr扩增得到含tetr家族转录调控因子mftr基因片段所用的引物由seq id no.6和seq id no.7所示的核苷酸序列组成；所述pcr扩增得到pset159的骨架片段所用的引物由seq id no.4和seq id no.5所示的核苷酸序列组成；所述pcr扩增得到perme*启动子的基因片段所用的引物由seq id no.8和seq id no.9所示的核苷酸序列组成。
25、在本发明中，所述须糖多孢菌为须糖多孢菌菌株saccharopolyspora pogonaasagf58。
26、本发明进一步提供了利用上述须糖多孢菌工程菌株在生产丁烯基多杀菌素中的应用。
27、本发明利用须糖多孢菌工程菌株生产丁烯基多杀菌素的方法，包括如下步骤：发酵培养上述须糖多孢菌工程菌株，得到所述丁烯基多杀菌素。
28、在本发明具体的实施方式中，所述发酵培养的条件为将上述须糖多孢菌工程菌株接种在发酵培养基中，在30℃、200r/min下进行发酵培养7d或以上。
29、本发明的有益效果如下：
30、本发明利用perme*启动子在须糖多孢菌内过表达tetr家族转录调控因子mftr基因，显著提高了丁烯基多杀菌素产量。利用本发明方法获得的须糖多孢菌工程菌株在摇瓶发酵实验中的产量较野生须糖多孢菌提高了2.2倍，为丁烯基多杀菌素的工业化生产提供了优良菌种。
1.如下1)或2)任一应用：
2.一种高效合成丁烯基多杀菌素的须糖多孢菌工程菌株，其特征在于，所述须糖多孢菌工程菌株是以须糖多孢菌为出发菌过表达tetr家族转录调控因子mftr基因所得。
3.根据权利要求1所述的应用或权利要求2所述的须糖多孢菌工程菌株，其特征在于，所述过表达tetr家族转录调控因子mftr基因是利用perme*启动子过表达tetr家族转录调控因子mftr基因。
4.根据权利要求1所述的应用或权利要求2所述的须糖多孢菌工程菌株，所述tetr家族转录调控因子mftr基因为如下任一所述的核苷酸序列：
5.根据权利要求1所述的应用或权利要求3所述的须糖多孢菌工程菌株，其特征在于，所述perme*启动子的核苷酸序列如seq id no.3所示。
6.根据权利要求3所述的须糖多孢菌工程菌株，其特征在于，所述以须糖多孢菌为出发菌利用perme*启动子过表达tetr家族转录调控因子mftr基因是在须糖多孢菌中导入含有perme*启动子和连接在所述perme*启动子后的tetr家族转录调控因子mftr基因的基因表达框的质粒；
7.权利要求2-6任一所述的须糖多孢菌工程菌株的构建方法，其特征在于，包括：将含有perme*启动子和连接在所述perme*启动子后的tetr家族转录调控因子mftr基因的基因表达框的质粒转化到须糖多孢菌中，获得须糖多孢菌工程菌株。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
9.权利要求2-6任一所述的须糖多孢菌工程菌株在生产丁烯基多杀菌素中的应用。
10.一种利用须糖多孢菌工程菌株生产丁烯基多杀菌素的方法，其特征在于，包括如下步骤：发酵培养权利要求2-6任一所述的须糖多孢菌工程菌株，得到所述丁烯基多杀菌素。
