本发明涉及生物，尤其涉及一种多重巢式rt-pcr检测与白血病相关的40种融合基因的方法。
背景技术：
1、急性白血病是儿童最常见的肿瘤，约占儿童肿瘤的30％。其中，急性髓系白血病(acute myeloidleukemia，aml)占儿童白血病的15％-20％。在过去几十年中，遗传学危险分层的应用、联合化疗方案的改进、小分子靶向药的应用和造血干细胞移植术的进展使得儿童aml的预后取得极大改善。目前aml的总体存活率已高达75％，但仍有25％～35％的患者复发。因此，早期诊断、准确分型、评估预后并及早预测复发，是目前儿童aml治疗和研究的重点。
2、融合基因是白血病中常见且重要的分子生物学异常，大多数已明确病理意义的融合基因伴随肿瘤细胞稳定存在，可作为白血病诊断、分型、预后评估、治疗方案选择及靶向药物研发的重要依据，也可作为高灵敏度监测微小残留病变的分子标志。尽管白血病的基础研究和临床疗效有了长远进步，基因研究的先进技术方法也不断涌现，且部分己用于临床，为疾病的基因诊断和治疗提供切实依据和可行手段，但是仍有一些患者经常规染色体核型分析检出具有正常核型、+8或者复杂核型等。研究表明，aml的正常核型检出率为40％-50％。这是由于白血病细胞难于获得多量的、染色体分散均匀的中期分裂相，且常规细胞遗传学技术对小于一条带的微小染色体改变不敏感，加之实验周期长，不能及时提供诊断和治疗所需的结果，限制了其应用。不过，其一次检测就能对全部染色体的数目和结构异常进行筛查，能发现特异性染色体易位及其附加异常，因此它仍然是不可代替的常规检测技术。
3、dna的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链dna在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在dna聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，dna在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制dna的变性和复性，并设计引物做启动子，加入dna聚合酶、dntp就可以完成特定基因的体外复制。巢式pcr是一种变异的聚合酶链反应(pcr)，使用两对(而非一对)pcr引物扩增完整的片段。第一对pcr引物扩增片段和普通pcr相似。第二对引物称为巢式引物(因为他们在第一次pcr扩增片段的内部)结合在第一次pcr产物内部，使得第二次pcr扩增片段短于第一次扩增。巢式pcr的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式pcr的扩增特异性强。
技术实现思路
1、本发明采用多重巢式rt-pcr技术检测与白血病相关的40种融合基因，共117个断裂点。此法可以灵敏、快速、有效地识别染色体改变形成的融合基因，从而为白血病的诊断、疗效判定及预后提供重要依据。
2、本发明提供了多重巢式rt-pcr检测与白血病相关的40种融合基因的方法，所述方法包括如下步骤：
3、s1.确定目标融合基因；
4、s2.引物设计；
5、s3.引物筛选；
6、s4.混合引物测试；
7、s5.性能验证；
8、s6.样本测试。
9、所述目标融合基因为bcr-abl1(190)、bcr-abl1(210)、bcr-abl1(230)、tel-abl1、tel-pdgfrb、hox11l2、cbfb-myh11、mll-af5、mll-af9、mll-af1q、mll-af1p、mll-afx、mll-af17、mll-af6、mll-enl、mll-ell、mll-af10、mll-af4、mll-sept6、dek-can、set-can、fip1l1-pdgfra、etv6-pdgfra、strn-pdgfra、cdk5rap2-pdgfra、bcr-pdgfra、kif5b-pdgfra、pml-rara-s、pml-rara-l、pml-rara-v、e2a-pbx1、e2a-hlf、sil-tal1、tel-aml1、tel-jak2、hlxb9-etv6、aml1-eto、aml1-mds1、aml1-mtg16、tls-erg。
10、在第一轮pcr中，所述目标融合基因的引物序列如下：
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14、在第二轮pcr中，所述目标融合基因的引物序列如下：
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18、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
19、白血病的检测方法主要有形态学检查、免疫学检测、细胞遗传学检测、荧光原位杂交技术、分子生物学检测等。本发明采用巢氏pcr方法属于分子生物学检测，该方法能同时检测多种目的基因，具有简便、经济、准确的优点。巢式pcr技术检测融合基因的应用范围广泛，它不受染色体中期分裂相数目的影响，可以检测微小克隆异常。它不仅可以识别少见的染色体易位，也能检测出隐匿的染色体异常，这就为临床mrd检测提供了先进的检测方法
1.一种多重巢式rt-pcr检测与白血病相关的40种融合基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标融合基因的第1次pcr引物序列见seq id no.1-101。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标融合基因的第1次pcr引物序列见seq id no.102-204。
