本发明属于肿瘤免疫治疗，具体涉及一种基于多价多肽识别的car-nk细胞的设计构建及应用
背景技术：
1、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)基本结构由胞外抗原识别域、跨膜区和胞内信号域组成。胞外抗原识别域通常由单链抗体可变片段(scfv)构成，可以特异性识别并结合靶抗原。跨膜结构域由疏水性α螺旋组成，主要作用是将car锚固在工程细胞膜上。胞内信号结构域，如cd28、4-1bb或ox40等结构域，通常起到触发免疫细胞激活和杀伤的作用。
2、近年来，免疫疗法在肿瘤治疗方面取得了很大的成功并成为研究的热点。目前，全球已经有7种car-t细胞疗法产品获批，应用于多种血液恶性肿瘤的治疗。然而，随着car-t疗法的迅速发展，新的挑战接踵而至。虽然car-t细胞疗法取得了成功，但是也面临了很多问题。car-t细胞疗法中是采用患者自体t细胞进行表达，制备工艺繁琐、制备周期过长以及高昂的价格导致其无法得到广泛的应用。另外，car-t疗法可能出现的细胞因子释放综合征(crs)、移植物抗宿主病(gvhd)以及神经毒性等副作用也是不容忽视的问题。
3、肿瘤微环境(tumor microenvironment，简称tme)，主要由肿瘤细胞，及其周围的免疫和炎症细胞，肿瘤相关的成纤维细胞，和附近的间质组织，微血管，以及各种细胞因子和趋化因子构成，是一个复杂的综合系统。在肿瘤生长过程中，癌细胞和肿瘤微环境成分不断适应环境条件，促进肿瘤的整体生长。因此有效地靶向肿瘤微环境即靶向肿瘤微环境的多个靶点是攻克实体瘤的关键。靶抗原可根据组织分布分为肿瘤特异性抗原(tsa)和肿瘤相关抗原(taa)。tsa是指仅仅表达在肿瘤细胞表面而不表达在正常组织细胞表面的抗原。taa是指不仅表达在肿瘤细胞，同时也表达在正常细胞表面的抗原分子，如her2。目前，肿瘤特异性抗原较为缺乏且寻找较为困难，因此也难以获得肿瘤特异性抗原相关的抗体。此外，临床上大多数car靶点都是肿瘤相关抗原(taa)，单链抗体的亲和力较高，靶向taa的car疗法在临床应用时会引发非肿瘤靶向毒性(on-target，off-tumor)。
4、进一步地，肿瘤微环境一般都是免疫抑制微环境，现有技术中pd-1/pd-l1的免疫检查点疗法已经在临床上取得了一定的疗效。首先pd-l1在多种类型的肿瘤细胞上高表达，靶向pd-l1的car-t细胞疗法不仅能解除免疫抑制微环境，还能引导car-t细胞靶向肿瘤细胞；肿瘤细胞是肿瘤微环境中主要的成分，egfr在多种肿瘤细胞中均高表达，因此靶向egfr可以有效地抑制肿瘤的生长。肿瘤的发生发展和迁徙转移都与肿瘤微环境中的血管生成密切相关，肿瘤新生血管的存在促进肿瘤的无限增殖和转移，vegfr2是一个关键的受体，主要负责形成新生血管。现有技术中，通常选用两种靶向联合作用来协同杀伤肿瘤以增强治疗的效果，例如ling jiao等人研究表明靶向pd-l1和vegfr2的联合应用可以起到协同杀伤肿瘤的作用，黄延林和孙天元等人的研究均显示egfr和vegfr2的联合治疗对恶性胶质瘤的杀伤作用。
5、为了解决特异性抗原缺乏以及复杂的肿瘤微环境阻碍实体瘤治疗的困境，选择针对肿瘤微环境的多个taa靶点联合使用增强特异性以精准靶向杀伤肿瘤，防止脱靶。目前用单链抗体构建car细胞是最普遍的方法，但是因为单链抗体的分子量大，无法构建多价car细胞，即用单链抗体构建的car细胞无法靶向多个靶点，需要寻找一种能克服上述缺点的分子。
6、car-nk细胞疗法是通过基因工程手段修饰使nk细胞表达car分子，通过识别靶细胞(如病毒感染的细胞、癌细胞)表面的抗原(或受体)，然后激活免疫细胞下游信号分子，以此增强nk细胞对靶细胞的特异性杀伤的效果。car-nk细胞疗法已然在血液瘤方面取得了不错的疗效，但是在实体瘤方面的疗效并不好，其中实体瘤复杂的肿瘤微环境和实体瘤特异性抗原的缺乏是最主要的原因之一。中国发明专利cn 114249834a公开了一种能够特异性靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体、其表达基因、其修饰的nk细胞及应用，其中，所述嵌合抗原受体包括依次连接的胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号结构域，其中，所述胞外抗原结合结构域包含能够特异性靶向结合肿瘤细胞或病原的多肽，通过单价多肽-car-nk来介导对肿瘤细胞的杀伤，但是单价多肽-car-nk细胞容易产生脱靶，对肿瘤细胞的靶向杀伤能力以及对实体瘤的浸润能力是有限的，而且无法同时靶向肿瘤微环境，会限制car-nk细胞对实体瘤的疗效，因此可以通过构建多价多肽car-nk来提高对肿瘤的靶向杀伤能力和减少脱靶。
7、基于上述分析，本发明通过提供一种具有特异性靶向肿瘤细胞和肿瘤微环境的多价多肽car-nk细胞，来提高对实体瘤的杀伤作用，以解决现有技术中存在的问题。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种基于多价多肽识别的car-nk细胞的设计构建及应用，通过工程化nk细胞的策略，联合多个靶点靶向肿瘤微环境和肿瘤细胞，减少脱靶和增强对实体瘤的杀伤能力。
2、为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案，一种基于多价多肽识别的car-nk细胞的构建方法，通过对胞外抗原结合结构域进行改造，将多肽tpp1、多肽l1、多肽s1作为胞外结合结构域，构建多肽为基础的三特异性car-nk细胞；所述多肽tpp1能够特异性靶向pd-l1，所述多肽l1能够特异性靶向egfr，所述多肽s1能够特异性靶向肿瘤微环境中新生血管的vegfr2。
3、优选地，所述多价多肽car-nk细胞中，所述多肽s1用于识别肿瘤微环境新生血管的vegfr2(vascular endothelial growth factor receptor 2，血管内皮细胞生长因子受体2，简称又称flk-1)受体，肿瘤的发生发展和迁徙转移都与肿瘤血管生成密切相关，所述多肽s1靶向vegfr2受体来破坏肿瘤新生血管的生成。
4、优选地，所述多价多肽car-nk包括依次串联的多肽tpp1-多肽l1-多肽s1-car-nk。
5、优选地，所述多肽tpp1的序列如seq id no.1所示；所述多肽l1如seq id no.2所示；所述多肽s1如seq id no.3所示；其中，seq id no.1的序列为sgqyasyhcwcwrdpgrsggsk；seq id no.2的序列为klarllt；seq id no.3的序列为lidhewkenyfplsf。
6、优选地，所述肿瘤细胞包括人非小细胞肺癌h460、非小细胞肺癌a549细胞、人肝癌细胞hepg2中的至少一种。
7、优选地，所述肿瘤细胞作为靶细胞，所述多价多肽car-nk细胞作为效应细胞进行实验，效靶比为1∶2，1∶1，2∶1；4∶1；8∶1；16∶1。
8、作为本发明的目的之一，还提供了一种多价多肽car-nk细胞，采用上述的构建方法得到。
9、作为本发明的目的之一，还提供了一种多价多肽car质粒载体，所述表达载体中含有上述的多价多肽car-nk细胞的表达基因。
10、所述表达基因的序列从5’端到3’端的顺序按照多肽序列-myc标签序列-nkg2d序列-2b4序列-cd3ζ进行基因合成得到；所述表达基因连接到慢病毒包装质粒上，构建出的所述表达载体。
11、优选地，所述多肽系列包括依次串联的多肽tpp1-多肽l1-多肽s1-car-nk。
12、作为本发明的目的之一，还提供了一种能够特异性靶向肿瘤细胞和肿瘤微环境的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体中的胞外抗原结合结构域，所述胞外抗原结合结构域中包括所述的多价多肽car-nk细胞。
13、作为本发明的目的之一，还提供了一种药物组合物，有效成分至少包括如权利要求8所述的基于多价多肽识别的car-nk细胞的嵌合抗原受体；所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
14、进一步地，本发明还提供了上述的多价多肽car-nk细胞在制备用于治疗肿瘤疾病的药物中的应用；其中，所述肿瘤疾病选自肺癌。
15、尤其地，nk细胞与t细胞相比是一种具有优势的car载体细胞，主要表现在以下几个方面：第一，相比于t细胞，nk细胞作为先天免疫系统的成分保留了天然受体识别，因此具有靶向肿瘤细胞的内在能力，从而减少了肿瘤细胞通过下调靶抗原的表达从而逃逸的可能性；第二，car-nk细胞是mhc非限制性的，不会引起严重的gvhd，具有良好的安全性；第三，car-nk细胞由于不需要经过严格的hla匹配，因而多种来源nk细胞如异体nk细胞、nk92细胞系都可以用于car-nk的构建，有望成为潜在的“现货型”抗肿瘤产品。第四，car-nk细胞在体内的存续时间较短，产生细胞因子的能力弱于t细胞，几乎不会发生crs和神经毒性等不良反应；第五，car-nk细胞的制备成本远比car-t细胞的制备成本低得多，并且car-nk有望选择重复治疗周期，在临床治疗中更具优势。
16、进一步地，多肽由于分子量小，且具有相对于单链抗体稍低的靶向结合抗原的能力，因此可以用多肽代替抗体来串联多个靶向不同靶点的多肽以构建多价多肽car细胞，同时多肽比抗体稍低的亲和力避免靶向正常组织，从而克服由于单链抗体分子量大无法构建多价car以及脱靶的难题。多肽药物本质上是指2～50个氨基酸所组成的肽链，多肽和蛋白一样，也是氨基酸通过肽键连接在一起形成的化合物，因此靶向多肽在功能理论上具有和抗体相类似的性质，具有部分替代抗体的功能。多肽具有分子量小，成本低，易于体外合成并修饰，优良的组织渗透性，能深入肿瘤内部，免疫原性低等优良特点。
17、本发明将多肽tpp1、多肽l1、多肽s1进行串联构建多价多肽car细胞，通过同时靶向pd-l1，egfr和vegfr2来协同杀伤肿瘤以达到增强治疗效果的作用。
18、此外，因此本发明选取靶向pd-l1、egfr、vegfr2的三条靶向性多肽来构建car-nk细胞，通过靶向肿瘤细胞和肿瘤微环境来增强对实体瘤的杀伤。
19、与现有技术相比，本发明的至少具有以下有益效果：
20、1.采用本发明的技术方案，采用靶向pd-l1、egfr、vegfr2三个靶向性多肽构建car-nk细胞，同时通过靶向肿瘤细胞和肿瘤微环境来杀伤实体瘤；多肽tpp1可以与pd-l1特异性结合；多肽l1可以与egfr特异性结合；多肽s1可以识别肿瘤血管中的vegfr2。同时靶向pd-l1、egfr、vegfr2可以起到协同杀伤肿瘤增强治疗效果的作用。
21、2.本发明通过改造胞外抗原结合结构域，将多价多肽(多肽tpp1、多肽l1、多肽s1)代替单链抗体作为胞外结合结构域，成功构建靶向pd-l1、egfr和vegfr2的三特异性car-nk细胞，用多价多肽构建的car-nk细胞，增强了靶向杀伤能力并减少脱靶，使car-nk细胞更好地深入实体瘤中，解决car-nk对实体瘤杀伤效果不佳的难题。
22、3.采用本发明技术方案构建的多价多肽car-nk细胞，其中多肽tpp1特异性靶向结合pd-l1不仅可以使nk细胞靶向杀伤肿瘤，还能阻断pd-l1与pd-1结合，解除肿瘤抑制微环境；多肽l1可以与egfr特异性结合，仅允许car与过度表达egfr的肿瘤细胞结合，避免了非肿瘤靶向毒性。
1.一种基于多价多肽识别的car-nk细胞的构建方法，通过对胞外抗原结合结构域进行改造，联合使用多肽tpp1、多肽l1、多肽s1作为胞外结合结构域，构建以多肽为基础的car-nk细胞；所述多肽tpp1能够特异性靶向pd-l1，所述多肽l1能够特异性靶向egfr，所述多肽s1能够特异性靶向肿瘤血管的vegfr2。
2.根据权利要求1所述的基于多价多肽识别的car-nk细胞的构建方法，其特征在于，所述多价多肽car-nk细胞中，所述多肽s1用于识别肿瘤新生血管的vegfr2受体，肿瘤的发生发展和迁徙转移都与肿瘤血管生成密切相关，所述多肽s1靶向vegfr2来破坏肿瘤新生血管的生成。
3.根据权利要求1所述的基于多价多肽识别的car-nk细胞的构建方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的基于多价多肽识别的car-nk细胞的构建方法，其特征在于，所述多肽tpp1的序列如seq id no.1所示；所述多肽l1如seq id no.2所示；所述多肽s1如seqid no.3所示。
5.根据权利要求1所述的基于多价多肽识别的car-nk细胞的构建方法，其特征在于，所述肿瘤细胞包括人非小细胞肺癌h460、非小细胞肺癌a549细胞中的至少一种；
6.一种多价多肽car-nk细胞，采用如权利要求1-5任一项所述的构建方法得到。
7.一种多价多肽car质粒载体，其特征在于，所述表达载体中含有如权利要求5所述的多价多肽car-nk细胞的表达基因；
8.一种能够特异性靶向肿瘤细胞及肿瘤微环境的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体中的胞外抗原结合结构域，所述胞外抗原结合结构域中包括如权利要求6所述的多价多肽car-nk细胞。
9.一种药物组合物，有效成分至少包括如权利要求8所述的基于多价多肽识别的car-nk细胞的嵌合抗原受体；所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
10.根据权利要求6所述的多价多肽car-nk细胞在制备用于治疗肿瘤疾病的药物中的应用；其中，所述肿瘤疾病选自肺癌。
