本发明涉及dna荧光原位检测领域，具体地说是一种基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统。
背景技术：
1、原位杂交技术(in situ hybridization，ish)是以标记的核酸分子为探针，原位检测细胞或组织中的dna或rna的技术。
2、其中以荧光基团作为标记的荧光原位杂交技术(fluorescence in situhybridization，fish)是目前检测染色体倍型和结构变化的“金标准”，多种商业化fish试剂盒已经被开发出来并且在临床广泛应用。
3、但是，fish方法有几个局限性：①实验要求较高，需要特定仪器，比如原位杂交仪；②实验条件苛刻，需在72～95℃高温变性3～5分钟和使用致癌物质甲酰胺处理；③fish方法过程复杂，检测时间长，至少需要20小时；④较高的经济成本限制了其临床应用。
4、现有基于规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspacedshortpalindromic repeats,crispr)/cripsr相关(crispr-associated,cas)系统的dna原位成像技术中，酶促信号放大系统常常被用于提高检测灵敏度，但是原位酶促反应效率低、非特异性高、过程繁琐。而使用核酸信号放大复合物，其大体积限制了其靶标可及性。
5、现有的一种rcasfish原位检测方法，用于原位检测固定细胞中的rna；其中各组分均通过体外原核表达系统制备，无需多质粒共转染和真核表达；但是由于rna以单链形式存在，检测时需要额外添加pammer序列，且rna以高拷贝(>106拷贝)存在于细胞质中，具有较高的靶标可及性；相比之下，染色体dna与组蛋白结合，包裹紧密，且定位于细胞核中，其靶标可及性较差；而且在正常细胞中，染色体均以二倍体形式存在，染色体的低丰度性进一步增加了检测难度。
6、综上，本发明提供了一种基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统，以解决上述问题。
技术实现思路
1、本发明提供了一种基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统，基于染色体特异性串联重复序列拷贝数，并结合携带多个ms2rna适配体的sgrna骨架序列，实现靶序列原位检测的双重信号放大，以提高检测灵敏度，进一步实现仅使用单一信号放大系统进行多靶标同时成像的目的。
2、本发明具体的技术方案如下：
3、一种基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统，检测体系包括d10a和h840a核酸酶结构域双突变的s.pyogenes cas9蛋白(dcas9)，携带2～16拷贝ms2 rna适配体的sgrna和mcp荧光蛋白；
4、所述基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体原位检测系统，可用于人源固定细胞中46条染色体的原位检测，可通过配置有相应波长滤光片的共聚焦显微镜进行观察；
5、所述基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体原位检测系统，将染色体本身串联重复序列的多拷贝特征作为第一重“内部”信号放大，将携带多拷贝ms2 rna适配体的sgrna作为第二重“外部”信号放大；
6、所述sgrna包括原间隔序列和携带2～16拷贝ms2 rna适配体的骨架序列，发挥着“桥接”作用，一方面通过原间隔序列，使dcas9/sgrna复合物在全基因组中特异性识别并结合靶序列，另一方面通过骨架序列中的ms2 rna适配体序列募集mcp荧光蛋白以进行荧光原位成像。
7、优选的一种技术方案，sgrna的原间隔序列各自特异于不同的检测靶点，其靶序列为染色体特异性串联重复序列。
8、优选的一种技术方案，基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体原位检测系统能够满足≥20拷贝染色体特异性串联重复序列的检测。。
9、优选的一种技术方案，基于染色体α卫星序列和串联重复序列数据库(tandemrepeats database,trdb)(参数设置为：copy number≥20，pattern size≥12，％matches≥85％)、ucsc基因组浏览器(http://genome.ucsc.edu/)和crisprbar网站(http://genome.ucf.edu/crisprbar/)(参数设置为：start index为1，选择entire chromosome，copies选择20，off-target percentage选择20，off-target density range选择50,000)筛选染色体特异性串联重复系列。
10、优选的一种技术方案，所述检测体系中dcas9与携带不同拷贝ms2 rna适配体的sgrna的比例为1:1～1:2，dcas9的浓度为3～5nm，sgrna的浓度为3～10nm，mcp荧光蛋白浓度为5～10nm。
11、优选的一种技术方案，通过将roche blocking reagent(11096176001)溶解在马来酸缓冲液中(100mm maleic acid,150mm nacl,ph 7.5)配制10％(w/v)封闭试剂储存液，高压蒸汽灭菌(121℃，2小时)以去除其中rna酶的影响。
12、优选的一种技术方案，可以向hepes封闭/反应液中加入0.01×rna secure溶液，抑制rna酶的影响。
13、优选的一种技术方案，反应在hepes封闭/反应液中进行，包括如下组分：20mmhepes、100mm kcl、10mm mgcl2、0.1％(v/v)吐温20、5％(v/v)甘油、1％(w/v)rocheblocking reagent(11096176001)、1mm dtt。
14、优选的一种技术方案，dcasfish染色体原位检测系统得检测过程如下：
15、1、样本前处理：
16、a.玻片前处理：使用盐酸溶液和无水乙醇对粘附性盖玻片(20mm×20mm)进行处理；
17、b.若为贴壁细胞，需进行细胞爬片：接种细胞于玻片上，待细胞达到70～80％融合度时，使用固定液，比例为甲醇/冰乙酸＝1:1，和含有tritonx-100的pbs的通透液对细胞爬片进行固定和通透；
18、c.若为悬浮细胞，先使用固定液，比例为甲醇/冰乙酸＝1:1，对细胞进行固定，之后将细胞滴片于玻片上，再使用含有tritonx-100的pbs的通透液进行通透。
19、2、原位检测：
20、a.使用胃蛋白酶工作液对经过前处理的细胞样本进行消化；
21、b.加入hepes封闭/反应液进行封闭；
22、c.室温组装dcas9/ms2-sgrna复合物溶液后，与细胞样本进行孵育结合；
23、d.加入mcp荧光蛋白，与固定细胞样本进行孵育结合；
24、e.使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)对细胞核进行染色，通过配置有相应波长滤光片的共聚焦显微镜和宽场荧光显微镜进行观察。
25、优选的一种技术方案，dcasfish多色成像系统包括dcas9蛋白，针对不同靶位点的ms2-sgrna和携带不同荧光的mcp荧光蛋白。
26、优选的一种技术方案，所述多色成像系统中dcas9与sgrna的比例为1:1，dcas9的浓度为3nm，sgrna的浓度为3nm；所述多色成像系统采用2×，4×，6×，8×和16×ms2-sgrna时，mcp荧光蛋白浓度分别为12nm，24nm，36nm，48nm和96nm。
27、优选的一种技术方案，所述多色成像系统的原位检测在hepes封闭/反应液中进行，包括如下组分：20mm hepes、100mm kcl、10mm mgcl2、0.1％(v/v)吐温20、5％(v/v)甘油、1％(w/v)roche blocking reagent(11096176001)、1mm dtt。
28、优选的一种技术方案，将dcas9、靶向各染色体特异性串联重复序列的sgrna以及不同荧光标记的mcp蛋白在体外进行“一步法”共同孵育，将形成的dcas9/sgrna/mcp荧光蛋白复合物加入到固定细胞中，进行原位标记，从而实现多靶标的同时检测。
29、优选的一种技术方案，在进行多色成像时，若使用2×，4×，6×和8×的ms2-sgrna，样本前处理步骤如下：
30、a.玻片前处理：使用盐酸溶液和无水乙醇对粘附性盖玻片(20mm×20mm)进行处理；
31、b.若为固定细胞，需进行细胞爬片：接种细胞于玻片上，待细胞达到70～80％融合度时，使用固定液，比例为甲醇/冰乙酸＝1:1，和含有tritonx-100的pbs的通透液对细胞爬片进行固定和通透；
32、c.若为悬浮细胞，先使用固定液，比例为甲醇/冰乙酸＝1:1，对细胞进行固定，之后将细胞滴片于玻片上，再使用含有tritonx-100的pbs的通透液进行通透。
33、优选的一种技术方案，在进行多色成像时，若使用16×的ms2-sgrna，为了增加细胞样本的通透性，增加kcl低渗处理步骤，样本前处理步骤如下：
34、a.玻片前处理：使用盐酸溶液和无水乙醇对粘附性盖玻片(20mm×20mm)进行处理；
35、b.细胞样本制备：使用kcl低渗液(0.075m kcl)对细胞进行低渗处理，使用固定液(甲醇：冰乙酸＝1：1)进行预固定和固定，随后将吹打混匀的细胞进行滴片，使用通透液(含有0.5％tritonx-100的pbs)对细胞样本进行通透；
36、优选的一种技术方案，在进行多色成像时，使用2×，4×，6×，8×和16×的ms2-sgrna时，其原位检测步骤均如下：
37、a.使用胃蛋白酶工作液对固定细胞样本进行消化；
38、b.加入hepes封闭/反应液进行封闭；
39、c.室温下，“一步法”组装针对不同检测靶标的dcas9/ms2-sgrna/mcp荧光蛋白复合物；
40、d.加入上述复合物，与固定细胞样本进行孵育结合；
41、e.使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)对细胞核进行染色，通过配置有相应波长滤光片的共聚焦显微镜和宽场荧光显微镜进行观察。
42、优选的一种技术方案，待检靶标为胎儿染色体数目异常(如chr21、chr18、chr13、chrx、chry)以及常见的肿瘤细胞染色体非整倍体(如chr3、chr7、chr17)。
43、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
44、1.本发明使用dcas9/sgrna进行双链dna的局部变性，反应条件温和，无需高温变性，无需使用具有致癌性的甲酰胺；实验要求低，无需进行温度调节的精密温控设备；检测体系组分简单、易于操作，能够在3～4小时内完成检测。
45、2.本发明采用“非酶”信号放大反应体系，克服了低酶促反应效率导致低检测效率和高非特异性的问题，其标记效率>90％。
46、3.本发明通过使用多种荧光标记的mcp蛋白，建立了多色成像系统，实现了多通道显微成像，可用于对单一细胞样本进行多靶标的同时检测，有助于充分挖掘样本的染色体信息，提高检测速度和检测通量，充分发挥其临床检测价值。
1.一种基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统，其特征在于，包括检测体系，所述检测体系包括d10a和h840a核酸酶结构域双突变的s.pyogenes cas9蛋白，即dcas9，携带2～16拷贝ms2 rna适配体的sgrna和mcp荧光蛋白；
2.如权利要求1所述的一种基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统，其特征在于，所述sgrna的原间隔序列各自特异于不同的检测靶点，所述sgrna的靶序列为染色体特异性串联重复序列。
3.如权利要求1所述的一种基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统，其特征在于，所述基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统能够满足≥20拷贝染色体特异性串联重复序列的检测。
4.如权利要求2所述的一种基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统，其特征在于，所述基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统基于染色体α卫星序列和串联重复序列数据库、ucsc基因组浏览器和crisprbar网站筛选染色体特异性串联重复系列。
5.如权利要求1所述的一种基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统，其特征在于，所述检测体系中dcas9与携带不同拷贝ms2rna适配体的sgrna的比例为1:1～1:2，所述dcas9的浓度为3～5nm，所述sgrna的浓度为3～10nm，所述mcp荧光蛋白的浓度为5～10nm。
6.如权利要求1所述的一种基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统，其特征在于，包括原位标记反应，所述原位标记反应在hepes封闭/反应液中进行，包括以下组分：hepes、kcl、mgcl2、吐温20、甘油、roche blocking reagent、dtt。
7.如权利要求5所述的一种基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统，其特征在于，包括以下检测过程：
8.如权利要求1所述的一种基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统，其特征在于，包括多靶点多色标记，所述多靶点多色标记中检测体系包括dcas9蛋白、针对不同靶位点的ms2-sgrna和不同荧光的mcp荧光蛋白。
9.如权利要求7所述的一种基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统，其特征在于，所述多靶点多色标记中检测体系采用2×，4×，6×，8×和16×ms2-sgrna时，dcas9：ms2-sgrna：mcp荧光蛋白的比例分别为1：1：4、1：1：8、1：1：12、1：1：16、1：1：32。
10.如权利要求7所述的一种基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统，其特征在于，所述多靶点多色标记中原位标记反应在hepes封闭/反应液中进行，包括以下组分：hepes、kcl、mgcl2、吐温20、甘油、roche blocking reagent、dtt。
11.如权利要求7所述的一种基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统，其特征在于，所述基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统将dcas9、靶向各染色体特异性串联重复序列的ms2-sgrna以及不同荧光标记的mcp蛋白在体外进行“一步法”共同孵育，将形成的dcas9/ms2-sgrna/mcp荧光蛋白复合物加入到细胞样本中，进行原位标记，对多靶标进行同时检测。
12.如权利要求10所述的一种基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统，其特征在于，所述基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统在使用2×，4×，6×和8×的ms2-sgrna时，样本前处理过程包括：玻片前处理、贴壁细胞和悬浮细胞的预处理；
13.如权利要求11所述的一种基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统，其特征在于，包括以下检测过程：
14.如权利要求1-12任意一项所述的一种基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统，其特征在于，包括待检靶标，所述待检靶标包括胎儿染色体数目异常和肿瘤细胞染色体非整倍体。
15.如权利要求14所述的一种基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统，其特征在于，所述基于“内-外”双重信号放大的dcasfish染色体多色原位成像系统基于crispr/dcas9和ms2 rna适配体的非整倍体原位检测方法，在检测待检靶标中进行应用。
