本发明涉及生物技术和免疫学领域，具体而言，涉及一种car-nk细胞及其制备方法和应用。
背景技术：
1、癌症是危害人类健康的最重要疾病之一，发病率持续增高，现已成为严重的社会负担。迄今为止，肿瘤治疗从传统治疗方法(如手术切除、放射性疗法、化疗和靶向药物疗法)发展为目前的新型疗法——细胞免疫治疗。
2、细胞免疫疗法，又称过继细胞疗法，是一种旨在利用人体免疫系统消除癌症的创新治疗方法。近年来，基于嵌合抗原受体的t细胞免疫疗法(chimeric antigen receptort-cell immunotherapy,car-t)备受关注。car-t细胞作为一种“活”药，通过基因转导的方法使患者的t细胞表达嵌合抗原受体，使其既能够维持特异性识别并结合肿瘤抗原，又具备自我增殖和杀伤能力，从而达到治疗肿瘤的目的。但随着多种car-t药物获批上市，相关研究的深入以及临床治疗的应用不断增加，发现car-t细胞药物会产生一系列不良反应，比如car-t的细胞因子释放综合征(crs)和神经毒性、实体肿瘤对其的耐受性与抗性、肿瘤免疫抑制微环境等。如何抑制或避免car-t细胞药物产生的不良反应，找寻其他可替代的细胞免疫疗法成为亟待解决的问题之一。
3、鉴于此，特提出本发明。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供了一种car-nk细胞及其制备方法和应用。
2、本发明是这样实现的：
3、第一方面，本发明实施例提供了一种car-nk细胞，其为pd-1和tigit双基因敲除的car-nk细胞，所述car包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原robo1。
4、第二方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的car-nk细胞的制备方法，其包括：敲除car-nk细胞中的pd-1基因和tigit基因；其中，所述car为前述实施例中所述的car。
5、第三方面，本发明实施例提供了一种药物组合物，其活性成分包括：前述实施例所述的car-nk细胞或前述实施例所述的制备方法制备获得的car-nk细胞。
6、第四方面，本发明实施例提供了一种药物制剂，其活性成分包括：前述实施例所述的car-nk细胞或前述实施例所述的制备方法制备获得的car-nk细胞。
7、第五方面，本发明实施例提供了前述实施例所述的car-nk细胞或前述实施例所述的制备方法制备获得的car-nk细胞在制备用于治疗或辅助治疗肿瘤的药物中的应用。
8、第六方面，本发明实施例提供了前述实施例所述的car-nk细胞或前述实施例所述的制备方法制备获得的car-nk细胞在抑制肿瘤细胞的增殖和/或活性中的应用。
9、本发明具有以下有益效果：
10、本发明通过在car-nk细胞的基础上，进行pd-1和tigit基因的双敲除，有效阻断了肿瘤细胞对该细胞的免疫逃逸和免疫抑制作用，得到靶向robo1的加强型car-nk细胞。相对于pd-1-ko robo1 car-nk以及robo1 car-nk细胞株，pd-1&tigit-dko robo1 car-nk细胞株在体外实验中展现出更强的抗肿瘤活性(针对cd155高表达的靶细胞株，高效靶比短时间杀伤过程中pd-1&tigit-dko robo1 car-nk杀伤效果明显强于pd-1-ko robo1 car-nk和robo1 car-nk；针对pd-l1高表达的靶细胞株，低效靶比长效杀伤过程中，pd-1&tigit-dkorobo1 car-nk杀伤效果与pd-1-ko robo1 car-nk相当，且均好于robo1 car-nk细胞株)，明显提高了nk细胞对肿瘤细胞的杀伤活性和在肿瘤微环境下car-nk细胞的持续增殖水平。因此，pd-1&tigit-dko robo1 car-nk细胞将有望被开发成为安全有效的抗肿瘤生物制剂，具有很好的应用前景和临床应用价值。
1.一种car-nk细胞，其特征在于，其为pd-1和tigit双基因敲除的car-nk细胞，所述car包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原robo1。
2.根据权利要求1所述的car-nk细胞，其特征在于，所述抗原结合结构域为能够特异性结合肿瘤特异性抗原robo1的ig1、ig2、ig3、ig4、ig5、fn1、fn2和fn3结构域中的任意一种或多种的抗体或抗原结合片段；
3.根据权利要求2所述的car-nk细胞，其特征在于，所述car还包含：跨膜结构域和/或共刺激信号传导区；
4.如权利要求1～3任一项所述的car-nk细胞的制备方法，其特征在于，其包括：敲除car-nk细胞中的pd-1基因和tigit基因；其中，所述car为权利要求1～3任一项中所述的car。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述敲除的技术选自cre-loxp敲除技术、crispr/cas9技术、人工核酸酶介导的锌指核酸酶技术和转录激活因子样效应物核酸酶技术中的任意一种或多种；
6.一种药物组合物，其特征在于，其活性成分包括：权利要求1～3任一项所述的car-nk细胞或权利要求4或5所述的制备方法制备获得的car-nk细胞；
7.一种药物制剂，其特征在于，其活性成分包括：权利要求1～3任一项所述的car-nk细胞或权利要求4或5所述的制备方法制备获得的car-nk细胞。
8.权利要求1～3任一项所述的car-nk细胞或权利要求4或5所述的制备方法制备获得的car-nk细胞在制备用于治疗或辅助治疗肿瘤的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括：高表达robo1的相关肿瘤；
10.权利要求1～3任一项所述的car-nk细胞或权利要求4或5所述的制备方法制备获得的car-nk细胞在抑制肿瘤细胞的增殖和/或活性中的应用；
