本发明涉及食用菌培育领域，具体涉及一种抗菌高糖裂褶菌杂交育种方法。
背景技术：
1、裂褶菌又称白参、树花、鸡毛菌、八担柴，隶属裂褶菌科、裂褶菌属。裂褶菌营养丰富，质地鲜嫩，具有独特的浓郁香气，且具有抗肿瘤性、抗疲劳、调节免疫功能等功能，裂褶菌蛋白含量高，且有多糖等活性物质，具有重要的药用价值。
2、近年来，裂褶菌已广泛应用于食品工业、医药卫生等领域。市场需求日益增大，不能满足市场需求。裂褶菌商品化栽培发展缓慢，生物效率低下，制约了裂褶菌的大规模生产。国内侧重于研究裂褶菌的发酵工艺以及栽培工艺和药用价值等，对裂褶菌的抗菌性、含糖量以及生物量等少有涉及，且裂褶菌有较厚的细胞壁，其杂交过程也比较受限。
技术实现思路
1、基于上述问题，本发明提供了一种抗菌高糖裂褶菌杂交育种方法。本发明通过亲本选择、出菇收集孢子、单孢分离、单核菌丝鉴别、单核菌丝配对杂交等方式筛选高糖、高生物量、具有抗菌性且生长状态良好的菌株，为规模化生产裂褶菌提供优良品种。
2、本发明提供了一种抗菌高糖裂褶菌杂交育种方法，其包括以下步骤：
3、（1）亲本选择：选择菌株号gxgd-ef-68-r-1为亲本，该菌株已于2023年04月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为gdmcc no：63362，并已在中国专利公开号：cn116590156 a公开，公开日：2023.08.15。
4、（2）出菇实验：经过菌丝生长阶段1和子实体诱导期2：收集孢子。
5、其中，菌丝生长阶段1：在培养箱中，20 ℃下避光培养，湿度不控，至气生菌丝布满培养基表面，约15-25 d。
6、其中，子实体诱导期2：1）骚菌：去掉表面的老块；2）崔蕾：低温刺激、温度控制在13-14 ℃，湿度控制在85-95 %，光照400lx；直至出现菇蕾，约10-15 d；3）菇的生长：抑制温度为4-6 ℃，湿度75 %，约3 d；4）菇的生长：恢复温度为10-15 ℃，光照600lx，湿度控制在85-95 %，约3-5 d；5）子实体收集：在1-2d内，采集开伞完全、朵型健壮的成熟菇。
7、（3）孢子悬浮液的制备：将收集的孢子置于0.8%的生理盐水中洗涤，8000rpm，10min，离心，去上清；再进行梯度稀释，通过血球计数板进行控制计数，调整孢子数量在200-500个孢子/ml，取0.1ml涂布于pda平板培养基，25℃恒温培养、观察。
8、pda平板培养基配方为：土豆200g/l、葡萄糖20g/l、磷酸二氢钾3g/l、硫酸镁1.5g/l、琼脂粉20g/l、vb1 0.1g/l、配以纯化水。土豆切块小于2cm方块，加入纯化水煮开20min后，加入其它配方后装瓶高温灭菌，121℃/20min。
9、（4）单孢子菌株的分筛：将步骤（1）中，长满菌落的平板进行挑选单菌落，在无菌室使用一次性无菌器械将挑选的单菌落重新接入pda中生长，长至满平板进行镜检，通过镜检观察其锁状结构，判定无锁状结构视为单核菌丝。挑选无锁状结构的单核菌丝体菌株为进一步杂交使用。
10、（5）单核菌丝体预处理：挑选出8株单核菌丝体菌株，采用两两杂交方式，设计共28组实验，将8株菌丝体分别，采用1m甘露醇水溶液进行清洗，得到的菌丝溶于溶壁酶液中混匀静置2h，为进一步实验做准备。
11、其中，溶壁酶液的配制为：20mg溶壁酶与1ml甘露醇水溶液（1mol/l）混合而成。
12、（6）点种杂交接种：分别按照左右点种杂交方法，2株孢子之间相距1-2cm，培养7-10天。
13、（7）融合菌株筛选：待两菌丝接触后，挑取交界处的部分菌丝进行镜检，如发现锁状联合，立即将其转接于新的pda培养基上，于22-25℃下培养7-10天。
14、（8）融合菌株稳定传代：将培养菌株菌丝生长旺盛、菌落形态均匀的菌株，转接三代，待其融合菌株稳定，再次进行镜检观察确认其形态结构，多次确是双核菌丝，杂交初步融合完成。
15、（9）高活性功能验证：将筛选后的菌株同亲本菌株接入黄豆汁培养瓶中生长，离心获得其菌体，烘干，按照差重法测定其生物量、按照国标法（gb/t 15672-2009）测其总糖量。
16、（10）抗菌性实验：将筛选获得的优势菌株zj4与原菌株与黄曲霉开展抗菌性实验，将两株菌分别选取1cm方块接入平板中，并在平板另一侧接入杂菌，进行抗菌性实验。
17、（11）与亲本拮抗试验：筛选出的菌株zj4，其菌丝与原菌株进行共培养，产生母本拮抗反应，显示其与母本非同一株菌。
18、本发明与现有技术相比，具有如下优点和技术效果：
19、（1）现有技术更侧重于裂褶菌的多糖提取以及发酵条件优化，本发明侧重于选育具有抗菌性裂褶菌，且兼具总糖含量高，生物量大等特点。
20、（2）由于裂褶菌菌丝细胞壁较厚，直接杂交耗时长，融合率低。本发明应用了溶壁酶，促进裂褶菌菌丝去壁，使得裂褶菌孢子混合液变为单细胞裂解液，更有利于杂交，杂交率由28.57%，提升到46.42%，且经转接三代融合稳定。
21、（3）本发明中杂交方式简单，不倚重于大型精密仪器设备，成本更加低廉，且实验过程绿色无污染，无过多繁琐步骤，更加快速便捷。因此，本发明选育了一株高产量、高糖、具有抗菌性的的裂褶菌杂交品种，为规模化生产提供优良杂交新品种
1.一种抗菌高糖裂褶菌杂交育种方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的抗菌高糖裂褶菌杂交育种方法，其特征在于，出菇选育为经过菌丝生长阶段和子实体诱导期，收集孢子。
3.根据权利要求2所述的抗菌高糖裂褶菌杂交育种方法，其特征在于，菌丝生长阶段：在培养箱中，20 ℃下避光培养，湿度不控，至气生菌丝布满培养基表面。
4.根据权利要求2所述的抗菌高糖裂褶菌杂交育种方法，其特征在于，子实体诱导期包括如下步骤：s1骚菌：去掉表面的老块；s2崔蕾：低温刺激、温度控制在13-14 ℃，湿度控制在85-95 %，光照400lx；直至出现菇蕾；s3菇的生长：抑制温度为4-6 ℃，湿度75 %，2-3 d；再恢复温度为10-15 ℃，光照600lx，湿度控制在85-95 %，生长3-5 d；s4子实体收集：在1-2d内，采集开伞完全、朵型健壮的成熟菇。
5.根据权利要求1所述的抗菌高糖裂褶菌杂交育种方法，其特征在于，孢子悬浮液中孢子数量在200-500个孢子/ml，取0.1ml涂布于pda平板培养基。
6.根据权利要求1所述的抗菌高糖裂褶菌杂交育种方法，其特征在于，pda平板培养基配方为：土豆200g/l、葡萄糖20g/l、磷酸二氢钾3g/l、硫酸镁1.5g/l、琼脂粉20g/l、维生素b1 0.1g/l、配以纯化水。
7.根据权利要求1所述的抗菌高糖裂褶菌杂交育种方法，其特征在于，溶壁酶液的配制为：20mg溶壁酶与1ml甘露醇水溶液混合而成，其中，甘露醇水溶液的浓度为1mol/l。
8.根据权利要求1所述的抗菌高糖裂褶菌杂交育种方法，其特征在于，黄豆汁培养瓶配方为：黄豆粉30g/l、酵母膏3g/l、葡萄糖30g/l、硫酸镁0.5g/l、七水硫酸亚铁0.18g/l、磷酸二氢钾0.5g/l。
