本公开涉及生物医药领域，具体地，本公开涉及一种复制缺陷型痘苗病毒天坛株及其应用。
背景技术：
1、痘苗病毒是目前已知结构上最为复杂的一种病毒，基因组为线状双链dna，长约200kb，编码200多个蛋白。通过hindⅲ酶切鉴定，基因组包括16个hindⅲ酶切片段，根据大小排序为a-p。基因组中央为保守区，基因高度保守，编码病毒外壳蛋白和病毒复制所需酶类；两侧为非保守区，基因变异较大，包括宿主范围基因、毒力基因、免疫调节基因等。
2、痘苗病毒用于天花疫苗，与猴痘病毒同属正痘病毒，存在广泛的血清交叉反应。多项观察性研究证明，天花疫苗对猴痘病毒的保护率约为85％。目前共两款猴痘疫苗获批，分别是由丹麦巴伐利亚北欧公司生产的mva-bn疫苗和日本km biologics公司生产的lc16疫苗。mva-bn疫苗的使用毒株为改良型痘苗病毒安卡拉株(mva)，mva是由痘苗病毒安卡拉株(cva)在鸡胚成纤维细胞(cef)中自然传代570次以上，与亲本株cva相比丢失了15％的基因，mva为复制缺陷型，无法在人源细胞中有效复制。lc16疫苗是由痘苗病毒lister株在低温条件下，经原代兔肾细胞多次传代而得，b5r基因缺失是lc16株的重要突变，l16株具有温度限制性、有限宿主范围、低致病性和低不良反应性。
3、痘苗病毒天坛株(vaccinia virus tiantan strain，vtt)作为我国预防天花的疫苗株，具备作为猴痘疫苗的潜能。但vtt小鼠颅内接种实验表明，对小鼠的致死率较高，具有一定的神经毒性，在接种过程中也表现出一定的毒性，可引入多种种痘并发症，如多型疹、水疱疹、紫癜、全身痘、坏疽痘和种痘脑炎等，给我国已普遍停止种痘后再恢复带来困难。而复制缺陷型痘苗病毒无法再人源细胞中有效复制，因此为提高vtt安全性，对其进行减毒改造为复制缺陷型是非常有必要的。通过连续传代方式进行减毒所需时间漫长且具有不可预测性，而目前对痘苗病毒的基因功能已有了较为全面的研究，通过基因工程方法选择性的敲除病毒基因组中的毒力基因、宿主范围基因、免疫调节基因和其它功能基因，从而筛选出安全有效的复制缺陷型痘苗病毒天坛株具有可行性。
4、痘苗病毒基因组左端c-k区域含有多个宿主范围基因、免疫调节基因和毒力基因，perkus等人将痘苗病毒wr株c-k区缺失21.7kb基因后，不能在人源细胞mrc-5中生长，将痘苗病毒copenhagen株c-k区缺失18kb基因后，不能在人源细胞中复制。从vtt基因组c-k区删除一定范围的基因，具有实现复制缺陷的潜能。
5、然而，尽管复制缺陷型痘苗病毒天坛株具备作为猴痘疫苗的潜能，但通过细胞连续传代方式构建复制缺陷型毒株所需时间漫长且具有不可预测性，通过基因工程方法构建时通常是在基因组c-k区随机删除一段序列，未说明不同删除范围对其减毒效果的影响，而痘苗病毒基因组c-k区删除不同范围基因对病毒减毒效果影响应不同。因此，寻找一种既能够实现复制缺陷潜能，又具有良好免疫原性的痘苗病毒天坛株成为当前研究中急需解决的问题。
技术实现思路
1、本发明的一个方面，是针对现有技术中缺少能够保证复制缺陷的潜能，和/或能够最大程度地维持其野生型结构，和/或具有良好的免疫原性的痘苗病毒天坛株，提供了一种复制缺陷型痘苗病毒天坛株及其应用。
2、具体地，本发明人利用同源重组原理用绿色荧光标记基因egfp分别替换vtt基因组中c-k区不同长度的非必须基因(c12-k2、c17-k2、c20-k2)，构建重组病毒rvtt-c12-k2-egfp、rvtt-c17-k2-egfp和rvtt-c20-k2-egfp，通过研究这3个重组病毒在不同细胞上的病毒蚀斑形态和复制水平、小鼠脑内毒力试验，验证了其复制缺陷的能力，从而解决了现有技术中存在的问题。
3、本发明提供的技术方案为：
4、一种复制缺陷型痘苗病毒天坛株，所述复制缺陷型痘苗病毒天坛株与原始痘苗病毒天坛株的基因组相比，至少缺失了所述基因组中c12基因至k2基因部分的基因序列。
5、具体地，在本公开的某些实施方式中，复制缺陷型痘苗病毒天坛株的构建方式如图1所示。选择敲除vtt基因组(genebank no:af095689)中c12-k2(11762bp-25450bp，包含18个基因：c12、c11、c10、c9、c8、c7、c6、c5、c4、c3、c2、c1、n1、n2、m1、m2、k1、k2)，c17-k2(7504bp-25450bp，包含23个基因，较c12-k2多5个基因：c17、c16、c15、c14、c13)及c20-k2(4274bp-25450bp，包含26个基因，较c12-k2多8个基因：c20、c19、c18、c17、c16、c15、c14、c13)，构建重组病毒rvtt-c12-k2-egfp、rvtt-c17-k2-egfp和rvtt-c20-k2-egfp。通过研究这3个重组病毒在不同细胞上的病毒蚀斑形态和复制水平、小鼠脑内毒力试验，获得毒力小的复制缺陷型毒株。
6、为了进一步实现本公开的目的，在上述vtt缺失c12-k2等实施方式的基础上，敲除a45r(144139bp-144669bp)以增强复制缺陷型毒株的免疫原性。
7、为了研究，在本公开的某些实施方式中，利用同源重组原理用绿色荧光标记基因egfp分别替换vtt基因组中c-k区不同长度的非必须基因(c12-k2、c17-k2、c20-k2)，构建重组病毒rvtt-c12-k2-egfp、rvtt-c17-k2-egfp和rvtt-c20-k2-egfp。具体构建方法包括：首先设计重组臂基因，依次为5’-拟删除基因左侧同源重组臂(500bp)-loxp序列-p7.5启动子-绿色荧光筛选标记基因egfp-t5nt终止信号-loxp序列-右侧同源重组臂(500bp)-3’，缺失vtt基因组中c12-k2、c17-k2、c20-k2及a45所使用重组臂基因序列分别为seq id no.1、2、3、4、5和6，化学合成并连接至载体puc57，分别为puc57-c12-k2、puc57-c17-k2、puc57-c20-k2及puc57-a45。
8、利用同源重组的原理将egfp基因作为外源筛选标记基因替换vtt基因组中拟敲除的基因。然后运用cre/loxp系统敲除egfp基因，获得不含外源标记基因的重组痘苗病毒。
9、基于以上研究，在本公开的某些实施方式中，所述c12至k2部分的基因序列由c12基因、c11基因、c10基因、c9基因、c8基因、c7基因、c6基因、c5基因、c4基因、c3基因、c2基因、c1基因、n1基因、n2基因、m1基因、m2基因、k1基因和k2基因组成。
10、在本公开的另一些实施方式中，所述复制缺陷型痘苗病毒天坛株与原始痘苗病毒天坛株的基因组相比，还缺失了c17基因、c16基因、c15基因、c14基因和c13基因。
11、在本公开的另一些实施方式中，所述复制缺陷型痘苗病毒天坛株与原始痘苗病毒天坛株的基因组相比，还缺失了c20基因、c19基因、c18基因、c17基因、c16基因、c15基因、c14基因和c13基因。
12、在本公开的另一些实施方式中，所述复制缺陷型痘苗病毒天坛株与原始痘苗病毒天坛株的基因组相比，还缺失了a45r基因。
13、本公开的另一个方面，是提供了上述复制缺陷型痘苗病毒天坛株在制备预防或治疗痘病毒科病毒感染的药物中的用途。作为优选，在本公开的一个实施方式中，所述痘病毒科病毒为猴痘病毒。
14、本公开的另一个方面，是提供了一种痘病毒科病毒疫苗，所述痘病毒科病毒疫苗包含上述复制缺陷型痘苗病毒天坛株，以及药学上可接受的载体。
15、本公开的另一个方面，是提供了上述复制缺陷型痘苗病毒天坛株在制备外源基因载体中的用途。
16、本公开的另一个方面，是提供了一种重组病毒，所述重组病毒的基因组中包括上述复制缺陷型痘苗病毒天坛株的序列。
17、本公开的另一个方面，是提供了上述重组病毒在制备疫苗或基因治疗药物中的用途。
18、本发明的有益效果为：
19、通过在不同细胞上的病毒蚀斑形态和复制水平、小鼠脑内毒力试验，表明本发明中vtt基因组分别缺失c20-k2、c17-k2、c12-k2基因后，毒力较亲本株vtt明显下降。进一步研究表明缺失a45r基因可以增强其免疫原性，rvtt-c12-k2-a45免疫小鼠和兔后能诱发产生针对猴痘病毒抗原的体液免疫反应。
1.一种复制缺陷型痘苗病毒天坛株，其特征在于，所述复制缺陷型痘苗病毒天坛株与原始痘苗病毒天坛株的基因组相比，至少缺失了所述基因组中c12基因至k2基因部分的基因序列。
2.根据权利要求1所述的复制缺陷型痘苗病毒天坛株，其特征在于，所述c12至k2部分的基因序列由c12基因、c11基因、c10基因、c9基因、c8基因、c7基因、c6基因、c5基因、c4基因、c3基因、c2基因、c1基因、n1基因、n2基因、m1基因、m2基因、k1基因和k2基因组成。
3.根据权利要求1所述的复制缺陷型痘苗病毒天坛株，其特征在于，所述复制缺陷型痘苗病毒天坛株与原始痘苗病毒天坛株的基因组相比，还缺失了c17基因、c16基因、c15基因、c14基因和c13基因。
4.根据权利要求1所述的复制缺陷型痘苗病毒天坛株，其特征在于，所述复制缺陷型痘苗病毒天坛株与原始痘苗病毒天坛株的基因组相比，还缺失了c20基因、c19基因、c18基因、c17基因、c16基因、c15基因、c14基因和c13基因。
5.根据权利要求1～4任意一项中所述的复制缺陷型痘苗病毒天坛株，其特征在于，所述复制缺陷型痘苗病毒天坛株与原始痘苗病毒天坛株的基因组相比，还缺失了a45r基因。
6.如权利要求1～5任意一项中所述的复制缺陷型痘苗病毒天坛株在制备预防或治疗痘病毒科病毒感染的药物中的用途；
7.一种痘病毒科病毒疫苗，其特征在于，所述痘病毒科病毒疫苗包含如权利要求1～5任意一项中所述的复制缺陷型痘苗病毒天坛株，以及药学上可接受的载体。
8.如权利要求1～5任意一项中所述的复制缺陷型痘苗病毒天坛株在制备外源基因载体中的用途。
9.一种重组病毒，其特征在于，所述重组病毒的基因组中包括如权利要求1～5任意一项中所述的复制缺陷型痘苗病毒天坛株的序列。
10.如权利要求9所述的重组病毒在制备疫苗或基因治疗药物中的用途。
