本发明涉及药用芍药栽培品种检测，特别是涉及一种鉴定药用芍药栽培品种的est-ssr标记引物及其应用。
背景技术：
1、芍药(paeonia lactiflora pall.)是毛茛科芍药属的多年生宿根草本植物，其根经加工后为药用，具有养血调经，敛阴止汗，柔肝止痛，平抑肝阳等功效。人工栽培的芍药主产于安徽亳州(亳白芍)、浙江杭州(杭白芍)、四川中江(川白芍)及山东菏泽(菏泽白芍)等地，各产区栽培历史悠久，形成了对应的品种分化。其中亳州产的“亳白芍”以其质地优良、药用价值高、产量大等特点，被誉为安徽省的“十大皖药”之一。安徽亳州地区通过对药用芍药的长期栽培，根据植物的形态学特征将“亳白芍”品种分为“线蒲”、“线条”、“蒲棒”3个品系。但是，近年来一些药农陆续引种了“杂花白芍”进行栽培以供药用，其根部加工后与“亳白芍”药材的性状特征极为相似，与“亳白芍”质量比较未见报道。研究表明，芍药栽培品种的不同会导致其在生长过程中代谢产物积累不同，不同来源白芍的主成分及其含量存在差异，造成其质量参差不齐。通过常规性状观察，很难对“亳白芍”三个品系和“杂花白芍”进行区分，造成白芍质量参差不齐及市售品系属性不清的问题。因此，需要建立科学、快速、准确的方法来鉴别“亳白芍”和“杂花白芍”，以此保证药用亳白芍的质量。
2、目前，分子标记技术被广泛应用于植物亲缘关系及遗传多样性分析、品种鉴定、群体遗传结构、辅助育种等方面。简单重复序列(ssr，simple sequence repeats)是一种以特异引物pcr为基础的分子标记技术，也称为微卫星dna，是一类由几个核苷酸(通常为1～6个)为基础单位的串联重复形成的dna片段，根据ssr的来源，通常可分为叶绿体简单重复序列(chloroplast simple sequence repeat，cpssr)、表达序列标签微卫星(expressedsequence tag-simple sequence repeat，est-ssr)和基因组微卫星(genome simplesequence repeat，gssr)三种类型。est-ssr标记源于基因组的转录区域，具有转移频率大，保守程度高，成本低等特点，在种间、属间、甚至科间具有较高的通用性。有报道利用est-ssr标记和形态性状检测31个芍药品种的遗传多样性，但其利用的是来源于牡丹的est-ssr标记。专利cn111944922a公开了基于芍药转录组测序开发的13对est-ssr引物，但其引物仅用于白芍观赏品种的鉴定。
3、目前，est-ssr标记在药用白芍品种领域研究较少，因此，开发est-ssr标记对于药用芍药栽培品种“亳白芍”的鉴定、保证亳白芍药材质量和保护亳白芍种质资源具有重要意义。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种鉴定药用芍药栽培品种的est-ssr标记引物及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明提供的est-ssr引物组不仅可用于药用栽培芍药“亳白芍”品种的鉴定，还可为中药材白芍的种质资源和新品种保护提供技术支持。
2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
3、本发明提供了一种鉴定药用芍药栽培品种的est-ssr标记引物，所述est-ssr标记引物选自p1到p10引物对中的任意一对或多对。
4、本发明还提供一种试剂盒，包含上述的est-ssr标记引物的任意一对或多对。
5、本发明还提供一种根据上述的est-ssr标记引物或上述的试剂盒在鉴定药用芍药栽培品种中的应用。
6、本发明还提供一种药用芍药栽培品种的鉴定方法，包括如下步骤：
7、以待检测芍药的dna为模板，利用上述的est-ssr标记引物进行pcr扩增，获得扩增产物；
8、将扩增产物进行电泳检测，获取扩增的条带数量以及扩增的片段大小信息；
9、根据条带数量和/或扩增的片段大小差异，鉴定是否为“亳白芍”品种。
10、进一步地，若扩增的条带数量一致和/或扩增的片段大小相同，则判定为同一品种；反之，则判定为不同品种。
11、进一步地，所述est-ssr标记引物中的上游引物均采用生物荧光基因进行修饰。
12、进一步地，所述生物荧光基因包含fam、hex、tamra或rox。
13、进一步地，所述pcr扩增的反应体系为：1μl模版dna，0.5μl上游引物和0.5μl下游引物，0.5μl dntp，2.5μl taq buffer，0.2μl taq酶，加ddh2o补足反应体系至25μl。
14、进一步地，所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，10个循环，复性温度每循环降0.5℃；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。
15、本发明还提供一种上述的est-ssr标记引物或试剂盒在药用芍药种质资源遗传多样性分析、遗传图谱构建或分子标记辅助育种中的应用。
16、本发明公开了以下技术效果：
17、1)本发明利用“亳白芍”三个品系和“杂花白芍”的转录组信息寻找est-ssr引物组，最终筛选得到10对引物，具有多态性丰富，扩增稳定，通用性高、重复性好等优点，利用任意一对，可对“亳白芍”和“杂花白芍”进行品种鉴定。
18、2)本发明提供的est-ssr引物组不仅可用于药用栽培芍药“亳白芍”品种的鉴定，还可以进一步的用于芍药种质资源遗传多样性分析、遗传图谱构建和分子标记辅助育种中，为中药材白芍的种质资源和新品种保护提供技术支持。
1.一种鉴定药用芍药栽培品种的est-ssr标记引物，其特征在于，所述est-ssr标记引物选自p1到p10引物对中的任意一对或多对：
2.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述est-ssr标记引物中的任意一对或多对。
3.根据权利要求1所述的est-ssr标记引物或权利要求2所述的试剂盒在鉴定药用芍药栽培品种中的应用。
4.一种药用芍药栽培品种的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的一种药用芍药栽培品种的鉴定方法，其特征在于，若扩增的条带数量一致和/或扩增的片段大小相同，则判定为同一品种；反之，则判定为不同品种。
6.根据权利要求4所述的一种药用芍药栽培品种的鉴定方法，其特征在于，所述est-ssr标记引物中的上游引物均采用生物荧光基因进行修饰。
7.根据权利要求6所述的一种药用芍药栽培品种的鉴定方法，其特征在于，所述生物荧光基因包含fam、hex、tamra或rox。
8.根据权利要求4所述的一种药用芍药栽培品种的鉴定方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应体系为：1μl模版dna、0.5μl上游引物、0.5μl下游引物、0.5μl dntp、2.5μl taqbuffer和0.2μl taq酶，加ddh2o补足反应体系至25μl。
9.根据权利要求4所述的一种药用芍药栽培品种的鉴定方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，10个循环，复性温度每循环降0.5℃；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。
10.一种如权利要求1所述的est-ssr标记引物或权利要求2所述的试剂盒在药用芍药种质资源遗传多样性分析、遗传图谱构建或分子标记辅助育种中的应用。
