本发明属于基因工程，具体涉及一种重组抗菌多肽及其制备方法和应用。
背景技术：
1、自青霉素发现以来，抗生素开始在全球广泛应用，人类逐渐进入控制和治疗微生物感染性疾病的时代。然而各种抗生素的滥用导致致病菌快速进化，造成耐药菌的大量出现，但是抗生素的研发却跟不上耐药菌进化速度。具有多种生物学功能的抗菌肽被发现具有抗菌谱广、抗菌活性高、不易产生抗药性、作用机理独特，热稳定性和水溶性好，对高等动物的正常细胞几乎无毒害作用，在蛋白质分子四级结构和物理化学性质方面显示出多样性等多重优势。
2、来源于人乳铁蛋白的抗菌肽称为乳铁蛋白肽h（lactoferricin human,lfcin-h），是由乳铁蛋白n端48个氨基酸组成的一条连续肽链。具有抗菌、抗炎、抗氧化美白等功效，可广泛应用于医学、美容、化妆品、保健品等领域中。
3、乳铁蛋白肽作为乳铁蛋白水解得到的产物产量低、工艺复杂、成本昂贵、人工合成乳铁蛋白肽及其衍生物费用更高，无法大规模生产，成为制约其广泛应用的重要制约因素。目前利用工程菌株产乳铁蛋白肽有较多报道，乳铁蛋白肽抗菌活性和抗病毒能力较乳铁蛋白弱，为了充分开发其潜在价值，亟需提高其抗菌活性和抗病毒能力。乳铁蛋白肽因其抗菌能力，对工程菌有杀伤作用。在表达的同时会大量杀伤宿主细胞，宿主蛋白大量释放，导致提纯困难，限制了其广泛应用。此外，由于杂蛋白较多，跑蛋白胶鉴定困难，而利用生物质谱技术研究乳铁蛋白肽的类型和含量，该方法只能检测其是乳铁蛋白肽，但不能确认其是否为全长片段，因此对于长片段肽链的全长性检测困难，进一步限制了其应用。
技术实现思路
1、基于上述技术问题，本发明旨在提供一种重组抗菌多肽及其制备方法和应用。为此本发明先通过空间结构模拟和average rmsf计算得到的一种空间结构稳定，活性位点较好的暴露在外侧的一种新的抗菌多肽，该重组抗菌多肽其抗菌性高于人乳铁蛋白肽；同时连接有亲和标签易于检测鉴定和提纯。
2、本发明提供了一种重组抗菌多肽，全长302个氨基酸，由6段完全相同的人乳铁蛋白肽串联而成，单个乳铁蛋白肽氨基酸序列如其氨基酸序列如seq id no：1所示：
3、grrrsvqwcavsqpeatkcfqwqrnmrkvrgppvscikrdspiqciqa。
4、进一步的，所述串联重复次数为大于或等于1的正整数，优选的，所述串联重复次数1-6次；更优选的，所述串联重复次数为6次，重复串联序列氨基端连接6his标签，羧基端为flag标签。其氨基酸序列如seq id no：2所示：
5、hhhhhhgrrrsvqwcavsqpeatkcfqwqrnmrkvrgppvscikrdspiqciqagrrrsvqwcavsqpeatkcfqwqrnmrkvrgppvscikrdspiqciqagrrrsvqwcavsqpeatkcfqwqrnmrkvrgppvscikrdspiqciqagrrrsvqwcavsqpeatkcfqwqrnmrkvrgppvscikrdspiqciqagrrrsvqwcavsqpeatkcfqwqrnmrkvrgppvscikrdspiqciqagrrrsvqwcavsqpeatkcfqwqrnmrkvrgppvscikrdspiqciqadykddddk
6、本发明还提供了一种经过人为优化设计的表达所述重组多肽的基因序列。所述基因的多核苷酸序列如seq id no：3所示：
7、catcaccatcatcaccacggccgacgacggagcgtgcagtggtgcgccgtaagtcagccggaagctacgaaatgcttccagtggcaacgtaatatgcgaaaagtgcgaggaccccccgtttcatgtataaagcgcgattcacctattcaatgcatacaagctggtcgaagacgtagcgttcaatggtgtgcggtctcccaaccagaggccactaaatgcttccaatggcagcggaacatgcgtaaggtccgcgggcctccggtttcgtgtataaaacgtgactcgccaattcaatgtattcaggcgggaaggcggcgcagtgttcagtggtgcgcagtttcccagccggaagcaacaaagtgctttcagtggcaaagaaacatgaggaaggtccgcggcccgccagtaagctgtatcaagagggactcgccaattcagtgcatccaagcaggtaggcggagatcggtacagtggtgtgcagtctctcaacctgaggctactaagtgtttccagtggcaacgtaacatgcgaaaggtacgtgggccacccgtgagttgcatcaagcgcgatagtcccatccagtgtattcaggcgggtcggaggcgcagcgttcaatggtgtgccgtgtctcagccggaggcaaccaaatgttttcagtggcaacggaatatgcggaaagtcagaggccctcccgtgtcttgtattaagagggactcacctatacagtgcatccaagctggacgtagaagatccgtacaatggtgtgccgtgtcccagccggaagccacgaaatgctttcaatggcaacgcaatatgcgaaaagtcagggggcctccagtatcttgcataaaaagagattcacccatacagtgcatccaagcggactacaaggatgacgatgacaaa。
8、本发明还提供了一种包含上述多核酸的重组载体，所述载体包括ppic9k。
9、本发明还提供了一种包含上述的重组载体、或表达所述重组多肽的重组工程菌。
10、进一步的，所述重组工程菌的宿主菌优选毕赤酵母。
11、根据本发明的实施例，所述重组工程菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：cgmcc no.29184；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为：2023年11月30日；分类命名为：巴斯德毕赤酵母 komagataella phaffii。
12、本发明还提供了一种生产上述的重组多肽的重组工程菌方法，所述方法包括以下步骤：
13、（1）设计重组多肽序列，优化编码dna序列；
14、进一步的，所述重组多肽全长302个氨基酸，由6段完全相同的人乳铁蛋白肽串联而成，氨基端连接6his标签，羧基端为flag标签。
15、进一步的，所述串联重复次数为大于或等于1的正整数，优选的，所述串联重复次数1-6次；更优选的，所述串联重复次数为6次，其氨基酸序列如seq id no：2所示；
16、进一步的，所述重组多肽经优化后的编码dna序列如seq id no：3所示的核苷酸序列。
17、（2）重组表达载体构建：
18、将步骤（1）中所述的dna序列克隆于表达载体ppic9k上，得到重组表达载体。
19、（3）将制备得到重组表达载体线性化后导入至毕赤酵母中，经筛选获得阳性克隆，得到重组的毕赤酵母菌种。
20、进一步的，构建的高拷贝、可高效表达外源基因的重组酵母工程菌种样本送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏编号为：cgmcc no.29184；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为：2023年11月30日。分类命名为：巴斯德毕赤酵母 komagataella phaffii。
21、本发明还提供了一种生产上述的重组多肽冻干海绵的方法，所述方法包括以下步骤：
22、（1）用5l罐高密度培养上述重组毕赤酵母菌种，诱导表达重组多肽；
23、（2）对步骤（1）所获得的发酵液进行固液分离，然后使用6his标签层析填料进行亲和层析，再使用flag标签层析填料进行亲和层析。经两步层析获得含有高纯度重组多肽的层析洗脱液。两个层析步骤可调换顺序。
24、优选地，所述步骤(2)中分离纯化为先采用6his标签的层析填料吸附重组多肽，再用flag标签的层析填料吸附重组多肽。
25、（3）对含有高纯度重组多肽的层析洗脱液进行超滤使得超滤浓缩液电导率＜1000us/ms；
26、（4）对超滤浓缩液进行冻干，最终获得重组多肽冻干海绵。
27、本发明还提供一种高纯度重组多肽在化妆品或保健品中的用途。
28、具体地，所述重组多肽应用于护肤品，所述护肤品各组分的质量分数为：根据上述所述的重组多肽0.1％-0.5％；保湿剂1％-10％；透明质酸钠0.1％-0.5％；氯化钠0.9％；其余为纯化水。
29、当所述重组多肽应用于保健品时，所述保健品各组分的质量分数为：重组多肽1%~10%；胶原蛋白1%~10%；透明质酸钠0.1%~0.5%；柠檬酸0.1%~10%；甘油0.1%~10%；其余为纯水。
30、本发明的有益效果：（1）本发明先通过空间结构模拟和average rmsf计算得到的一种空间结构稳定，活性位点较好的暴露在外侧的重组多肽，该重组多肽是由人乳铁蛋白肽重复串联6次构成，拥有更优的生物学活性，极大提高了抗菌活性；
31、（2）本发明的重组多肽在其两端携带有双特异性标签，可通过亲和纯化获得高纯度全长多肽，亦可以通过夹心法elisa检验鉴定其在产品中的状态和含量；
32、（3）本发明的重组多肽携带有n端的6his标签和c端的flag标签，利用其双特异性亲和纯化标签，纯化步骤简单，产物纯度高；
33、（4）相较于利用大肠杆菌为宿主细胞，本发明利用毕赤酵母为工程菌株，重组多肽无内毒素隐患。
1.重组抗菌多肽，其特征在于，所述重组抗菌多肽以如seq id no:1所示氨基酸序列的人乳铁蛋白肽为基础单元串联重复而成，所述串联重复次数为6次。
2.根据权利要求1所述的重组抗菌多肽，其特征在于，所述重组抗菌多肽的氨基端连接6his标签，羧基端连接flag标签，所述重组抗菌多肽的氨基酸序列如seq id no:2所示。
3.多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的重组抗菌多肽。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括seq id no:3所示的核苷酸序列。
5.重组载体，其特征在于，所述重组载体包含权利要求3或4所述的多核苷酸序列。
6.重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌包含权利要求3或4所述的多核苷酸序列，或权利要求5所述的重组载体。
7.根据权利要求6所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌的宿主细胞为毕赤酵母菌；所述重组工程菌是将权利要求5所述的重组载体线性化后导入至毕赤酵母中，经筛选获得阳性克隆即为重组的表达重组抗菌多肽的毕赤酵母工程菌种。
8.根据权利要求7所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：cgmcc no.29184；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为：2023年11月30日；分类命名为： komagataellaphaffii。
9.一种重组抗菌多肽冻干海绵的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.一种如权利要求1所述的重组抗菌多肽或权利要求9所述方法制备的重组抗菌多肽冻干海绵在化妆品或保健品中的应用。
