本发明涉及一种检测加工食品中芝麻过敏原蛋白的方法。具体地说，涉及一种通过具有加工稳定性的特征肽段实现检测加工食品中7种芝麻过敏原蛋白的方法。
背景技术：
1、芝麻(sesamumindicum l.)，胡麻科胡麻属，传统的油料作物之一，主要种植在河南、湖北、安徽、江西等地区，我国是芝麻主要生产和消费国。芝麻种皮有多种颜色，从白色到黑色呈现连续性变异，有白色、棕色、褐色、黑色等。不同颜色的芝麻在食品行业中的应用存在一定差异，白芝麻大多作为食品的原料，如用于面包、饼干等烘焙食品的制作；黄芝麻等杂色芝麻大多用于制备调味酱或榨油；黑芝麻主要用于生产芝麻糊、芝麻粉等食品。由于芝麻具有抗衰老、抗氧化、增强免疫能力等作用，也作为功能性成分开发保健食品或者新型食品，芝麻在食品行业中应用广泛。
2、芝麻是常见的食物过敏原。经世界卫生组织/国际免疫学会联合会(who/iuis)确认，芝麻过敏原蛋白主要有7种(ses i 1-ses i 7)。欧盟、澳新、加拿大、美国等国家要求在食品标签上标注芝麻过敏原信息。但是，在制作、储存和运输中，由于生产线或者生产设备的共同使用，芝麻可能掺入未标识食品中，影响过敏人群身体健康。此外，食物过敏原标签未规范化，常用“可能含有”等模糊词汇进行标识。
3、目前，主要从核酸和蛋白水平对芝麻过敏原进行检测，其中，基于核酸水平的检测方法有聚合酶链式反应(pcr)等分子生物学方法；基于蛋白水平的方法有免疫学方法、高效液相色谱串联质谱法(hplc-ms)等。由于加工食品基质具有复杂性，且加工工艺影响蛋白结构和核酸完整性，分子生物学和免疫学这两类方法在加工食品中芝麻过敏原检测的应用有限。通过鉴定目标过敏原蛋白的特征肽段，hplc-ms可以同时检测多种过敏原蛋白，实现高灵敏度检测。已有研究报道，筛选出芝麻过敏原蛋白ses i 6的3条特征肽段，对面包、饼干中芝麻过敏原蛋白进行检测。另一研究则确定了7种芝麻过敏原蛋白的特征肽段，利用同位素内标法定量食品中7种芝麻过敏原蛋白。以上研究中，均采用生芝麻为样品进行特征肽段的筛选。
4、然而，芝麻需要经过加工处理才能散发香气制作为食品。7种芝麻过敏原蛋白具有不同的特性，其结构会受到加工工艺的影响。采用150℃烘烤白芝麻15min，芝麻过敏蛋白的二级结构发生变化，随机卷曲增加，反平行β-折叠减少。当较低压力(100mpa，200mpa)处理芝麻，随机卷曲、α-螺旋和β-折叠发生转化，蛋白结构更加有序。以芝麻为样品，筛选出12条芝麻蛋白特征肽段，但在冷榨植物油中只鉴定出其中8条，这也表明高压等加工处理确实会影响芝麻过敏原蛋白结构，从而影响检测的准确性。因此，有必要筛选出具有加工稳定性的特征肽段，利于加工食品中芝麻过敏原蛋白的检测，并提高检测的准确性。
技术实现思路
1、本发明的目的在于以不同加工工艺制备的芝麻制品为样品，确定了9种具有良好特异性和加工稳定性的特征肽段，从而提供一种检测加工食品中7种芝麻过敏原蛋白的方法，实现了加工食品中芝麻过敏原的高通量和高灵敏检测，使得检测结果准确且稳定。
2、为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
3、一种检测加工食品中7种芝麻过敏原蛋白的方法，包括以下步骤：
4、(1)芝麻粗蛋白提取：对芝麻样品进行脱脂，加入蛋白提取缓冲溶液，采用振荡结合水浴超声辅助提取，获得芝麻粗蛋白提取液；
5、(2)胰蛋白酶消化：对于步骤(1)获得的芝麻粗蛋白提取液采用胰蛋白酶进行消化以获得水解肽段；
6、(3)基于超高效液相色谱-飞行时间高分辨质谱分析水解肽段：确定色谱和质谱条件分析水解肽段；
7、(4)特征肽段筛选：水解肽段经proteinpilot软件靶向分析鉴定，并经特异性验证确定7种芝麻过敏原蛋白中9条具有加工稳定性的特征肽段；
8、(5)scheduled mrm方法建立：针对9条芝麻过敏原特征肽段离子对进行质谱参数优化，基于高效液相色谱-三重四极杆质谱建立scheduled mrm方法，实现加工食品中7种芝麻过敏原蛋白的检测。
9、本发明的检测方法更进一步优选：
10、(1)芝麻粗蛋白提取：取适量芝麻样品液氮冷冻研磨。按照芝麻：己烷＝1：5的比例加入己烷，室温下搅拌20min，离心(4000rpm，10min)，弃去上清液，重复脱脂三次。称取1g脱脂芝麻粉末，加入10ml蛋白提取缓冲溶液(50mm tris-hcl+7m尿素+2m硫脲+4％chaps，ph8.5)，涡旋1min，室温下振荡提取20min，水浴超声20min。离心(12000rpm，20min)，上清液过0.22μm滤膜，测定粗提取液蛋白浓度。
11、(2)胰蛋白酶消化：取约200μg蛋白于离心管，加入质谱水至总体积为50μl。加入120mm dtt溶液10μl，水浴(37℃，1h)。加入600mm iaa溶液10μl避光反应15min。将液体转移至5kda超滤膜上，离心(12000rpm，20min)，加入100μl 50mmabc溶液，离心(12000rpm，15min)，重复三次。继续加入100μl 50mmabc溶液，以1：50质量比加入1μg/μl胰蛋白酶4μl，混匀，37℃水浴10h。取出超滤管，离心(12000rpm，20min)，加入100μl 25mmabc溶液，离心(12000rpm，15min)，重复三次。超滤管放入真空旋转蒸发仪，旋转干燥，加入100-200μl质谱水继续旋转干燥，重复3次。加入100μl流动相a(98％水-2％乙腈-0.1％甲酸)，涡旋混匀，离心(10000rpm，10min)，吸取80μl液体至液相小瓶，4℃短期保存。
12、(3)基于超高效液相色谱-飞行时间高分辨质谱分析水解肽段，测定条件如下：
13、色谱条件：色谱柱为xbridge peptide beh c18(4.6mm×150mm，3.5μm，waters公司)；流动相a为98％水-2％乙腈-0.1％甲酸；流动相b为98％乙腈-2％水-0.1％甲酸；流速为0.25ml/min；柱温40℃；进样量为5μl；梯度洗脱程序为：0～0.5min，5％～8％b；0.5～0.6min，8％～12％b；0.6～25min，12％～30％b；25～30min，30％～35％b；30～30.5min，35％～80％b；30.5～38min，80％b；38～38.5min，80％～5％b；38.5～50min，5％b。
14、质谱条件：nanosprayⅲ离子源；esi+正离子模式；喷雾电压2500v；雾化气6psi；气帘气30psi；温度150℃；信息依赖型采集工作模式；tof ms模式为350～1500m/z，250ms；tofms/ms模式为100～1500m/z，100ms，母离子电荷范围+2～+5；动态排除时间20s；循环时间2s；rolling ce为enabled，运行时间50min。
15、(4)特征肽段筛选：水解肽段经proteinpilot软件靶向分析鉴定，选择响应强度高、氨基酸个数6-15、无漏切位点、无非酶切断裂的肽段为预选特征肽段，利用blast分析这些肽段特异性，并以不同品种芝麻(表3)和常见食物过敏原(表4)为样品进行特异性验证。
16、表1芝麻主要7种过敏原蛋白
17、
18、表27种芝麻过敏原蛋白的特征肽段
19、
20、表3特异性验证阳性样品信息
21、
22、表4特异性验证阴性样品信息
23、
24、(5)scheduled mrm方法建立：利用开源软件skyline获取特征肽段离子对信息，以去簇电压和碰撞能量理论值为基础进行质谱参数的优化，确定特征肽段的最佳质谱参数，基于高效液相色谱-三重四极杆质谱建立scheduled mrm方法。检测条件如下：
25、色谱条件：色谱柱为xbridge peptide beh c18(4.6mm×150mm，3.5μm，waters公司)；流动相a为98％水-2％乙腈-0.1％甲酸；流动相b为98％乙腈-2％水-0.1％甲酸；流速为0.4ml/min；柱温40℃；进样量为10μl；梯度洗脱程序为：0.1～1min，3％b；1～10min，3％～30％b；10～13min，30％～55％b，13～13.1min，55％～80％b，13.1～16min，80％b，16～16.1min，80％～3％，16.1～20min，3％b。
26、质谱条件：esi+正离子模式；气帘气35psi；雾化气65psi；碰撞气medium；离子化电压4500v；离子源温度500℃；辅助气50psi；正离子扫描scheduled mrm模式，检测窗口120s，扫描时间3s。
27、表5芝麻过敏原蛋白特征肽段信息表
28、
29、
30、本发明进一步涉及具有加工稳定性的9条特征肽段在检测加工食品中7种芝麻过敏原蛋白的用途，所述的9条特征肽段如下：
31、ses i 1特征肽段1条：ylsqgr；
32、ses i 2特征肽段1条：hcmqwmr；
33、ses i 3特征肽段1条：gtislvr；
34、ses i 4特征肽段1条：qageaik；
35、ses i 5特征肽段1条：aphlqlqpr；
36、ses i 6特征肽段2条：glivmar和isgaqpslr；
37、ses i 7特征肽段2条：vfsstsr和nviqpr。
38、本发明的有益效果：
39、(1)本发明以12份加工芝麻制品为样品，通过超高效液相色谱-飞行时间高分辨质谱和proteinpilot软件筛选出7种芝麻过敏原蛋白的9条特征肽段。这些特征肽段不仅具有良好特异性，还具有加工稳定性。
40、(2)本发明优化了芝麻粗蛋白特征肽段质谱参数，提高了其质谱峰响应强度，建立了关于9条芝麻过敏原特征肽段的scheduled mrm方法。能实现加工食品中芝麻过敏原的高通量及高灵敏度检测，检测结果准确且稳定。
1.一种检测加工食品中7种芝麻过敏原蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，所述的9条芝麻过敏原蛋白特征肽段如下：
3.根据权利要求1所述的方法，步骤(1)中所述芝麻样品为芝麻经翻炒、研磨、水煮、烘烤、油炸和蒸制之一或组合加工工艺制备的产品，所述的蛋白提取缓冲溶液含有7m尿素、2m硫脲和4％chaps的50mm tris-hcl，ph 8.5。
4.根据权利要求1所述的方法，在步骤(2)前还包括蛋白还原和烷基化反应，即根据测定蛋白浓度，取约200μg蛋白于离心管中，加入适量体积的质谱水至总体积为50μl。加入120mm dtt溶液10μl，水浴(37℃，1h)。冷却至室温后，加入600mm iaa溶液10μl避光15min，完成蛋白烷基化反应。
5.根据权利要求1所述的方法，步骤(3)基于超高效液相色谱-飞行时间高分辨质谱分析水解肽段，测定条件如下：
6.根据权利要求1所述的方法，所述特征肽段筛选通过水解肽段经proteinpilot软件靶向分析鉴定，选择响应强度高、氨基酸个数6-15、无漏切位点、无非酶切断裂的肽段为预选特征肽段，利用blast分析这些肽段特异性，并以不同品种芝麻和常见食物过敏原为样品进行特异性验证。
7.根据权利要求1所述的方法，建立mrm方法所需特征肽段的离子对、保留时间、优化后的去簇电压和碰撞能量如表5所示：
8.根据权利要求1所述的方法，步骤(5)以scheduled mrm模式进行高效液相色谱-三重四极杆质谱测定的条件如下：
9.一种具有加工稳定性的9条特征肽段在检测加工食品中7种芝麻过敏原蛋白的用途，其特征在于，所述的9条特征肽段如下：
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述9条特征肽段通过权利要求1-8任一方法筛选确定。
