本发明属于基因工程，特别涉及一种通过限制吩嗪合成竞争途径促进吩嗪-1-羧酸生产的方法。
背景技术：
1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、化学农药对农业作物丰产、稳产至关重要，但不易降解化学农药的大量使用易造成环境污染，不可持续发展。生物源农药是一类很好的替代品，与化学农药相比，生物农药具有毒性低、对环境友好、易降解和不易产生抗药性等明显优势，已经吸引了越来越多学者的关注并逐渐应用到生物防治实践当中。其中，由假单胞菌、链霉菌生产的吩嗪类物质则是一类典型生物源农药的代表。其中吩嗪-1-羧酸因具有广谱、高效、安全和能有效控制真菌性根腐和茎腐等特性，主要用于防治水稻纹枯病、小麦赤霉病、黄瓜和西瓜的枯萎病、甜瓜蔓枯病、辣椒根腐病等，2011年被中华人民共和国农业农村部授予农药证书，并被命名为“申嗪霉素”。
3、目前吩嗪-1-羧酸生产方法虽有化工方法，但条件苛刻，并且向环境释放有毒有害物质，所以主要由假单胞菌生产，但目前因假单胞菌的生产效价不高，导致吩嗪-1-羧酸的生产成本高昂，限制了吩嗪-1-羧酸的推广应用，提高假单胞菌中吩嗪-1-羧酸的生产效价是目前的重要任务。
4、吩嗪-1-羧酸的生产可以用化学合成法之外的生物合成来进行，应用相对比较安全的绿针假单胞菌qlu-1作为生产菌株，但目前生产菌株的产量较低导致吩嗪-1-羧酸的生产成本高，提高工程菌的产量成为迫切需求。
5、发明人之前的专利zl202011026544.7公开了一株高产菌株qpca-7，但其吩嗪-1-羧酸的产量仍有待提升。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本发明提供一种通过限制吩嗪合成竞争途径促进吩嗪-1-羧酸生产的方法。假单胞菌中吩嗪的合成是利用莽草酸途径作为前导途径，而莽草酸途径作为假单胞菌中重要的合成途径，也是芳香族氨基酸、铁载体、水杨酸、辅酶q等的合成前导途径，本发明发现：在众多的吩嗪合成的竞争途径中，通过限制铁载体、水杨酸等的合成，引导更多的碳流进入吩嗪合成途径，可以显著地提高吩嗪-1-羧酸的合成效率。本发明以专利zl202011026544.7中高产菌株qpca-7作为出发菌株，通过限制铁载体、水杨酸等的合成，提高菌株pca的合成效率。
2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、本发明的第一个方面，提供了一种通过限制吩嗪合成竞争途径促进吩嗪-1-羧酸生产的基因工程菌株，所述工程菌株是敲除工程菌株qpca-7基因组中 ycac基因和/或 pabc基因而得；
4、所述工程菌株qpca-7是敲除绿针假单胞菌( pseudomonas chlororaphis) qlu-1中的 phzo基因、 lon基因、 rsme基因、 psra基因、 pars基因、 rpea基因和 pykf基因而得；
5、所述绿针假单胞菌qlu-1的保藏编号为cctccno：m2020108，已在专利zl202011026544.7中公开。
6、在一些实施方式中，所述 ycac基因的序列如seq id no.1所示。
7、在一些实施方式中，所述 pabc基因的序列如seq id no.7所示。
8、在一些实施方式中，敲除工程菌株qpca-7基因组中 ycac基因的具体步骤包括：
9、采用pcr钓取并连接 ycac基因的上下游片段，得到ycac-ud片段；
10、将ycac-ud片段连接质粒pk18mobsacb构建 ycac基因敲除质粒pk18-ycac-ud；
11、将所述 ycac基因敲除质粒pk18-ycac-ud导入大肠杆菌s17-1（λpir），再与绿针假单胞菌qpca-7进行双亲杂交培养，筛选阳性克隆，即得敲除 ycac基因的菌株qpca-8。
12、在一些实施方式中， ycac基因上下游融合片段的碱基序列如seq id no.2所示。
13、在一些实施方式中，所述 ycac基因敲除引物包括：ycac-f1、ycac-r1、ycac-f2、ycac-r2，序列分别如seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6所示。
14、在一些实施方式中，敲除工程菌株qpca-8基因组中 pabc基因的具体步骤包括：
15、采用pcr钓取并连接 pabc基因的上下游片段，得到pabc-ud片段；
16、将所述pabc-ud片段连接质粒pk18mobsacb构建 pabc基因敲除质粒pk18-pabc-ud；
17、将所述 pabc基因敲除质粒pk18-pabc-ud导入大肠杆菌s17-1（λpir），再与绿针假单胞菌qpca-8进行双亲杂交培养，筛选阳性克隆，即得敲除 pabc基因的菌株qpca-9。
18、在一些实施方式中， pabc基因上下游融合片段的碱基序列如seq id no.8所示。
19、在一些实施方式中， pabc基因敲除引物包括：pabc-f1、pabc-r1、pabc-f2、pabc-r2，序列分别如seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11、seq id no.12所示。
20、本发明的第二个方面，提供了一种通过限制吩嗪合成竞争途径促进吩嗪-1-羧酸生产的方法，包括：
21、将上述的基因工程菌株接种于发酵培养基中进行培养，即得。
22、其中，所述发酵培养基可以是kb培养基。
23、本发明的有益效果
24、(1)本发明通过限制吩嗪合成的竞争途径来提高吩嗪-1-羧酸的生产效价。本发明以zl202011026544.7中高产菌株qpca-7作为出发菌株，通过无痕敲除 ycac基因限制假单胞菌中铁载体的合成，获得工程菌株命名为qpca-8，经过发酵测产，发现qpca-8的pca产量提高到8914mg/l，本发明在qpca-8的基础上，敲掉 pabc基因，限制假单胞菌中水杨酸的生产，获得菌株qpca-9，经过测产，其吩嗪-1-羧酸的产量在48h时提高到9948mg/l。
25、(2)本发明通过限制吩嗪合成的水杨酸、铁载体等合成途径，利用kb培养基发酵，产量达到9948mg/l，实现了菌株吩嗪-1-羧酸产量的显著提升。
26、(3)本发明生产方法简单、实用性强，易于推广。
1.一种通过限制吩嗪合成竞争途径促进吩嗪-1-羧酸生产的基因工程菌株，其特征在于，所述工程菌株是敲除工程菌株qpca-7基因组中ycac基因和/或pabc基因而得；
2.如权利要求1所述的通过限制吩嗪合成竞争途径促进吩嗪-1-羧酸生产的基因工程菌株，其特征在于，所述ycac基因的序列如seq id no.1所示。
3.如权利要求1所述的通过限制吩嗪合成竞争途径促进吩嗪-1-羧酸生产的基因工程菌株，其特征在于，所述pabc基因的序列如seq id no.7所示。
4.如权利要求1所述的通过限制吩嗪合成竞争途径促进吩嗪-1-羧酸生产的基因工程菌株，其特征在于，敲除工程菌株qpca-7基因组中ycac基因的具体步骤包括：
5.如权利要求1所述的通过限制吩嗪合成竞争途径促进吩嗪-1-羧酸生产的基因工程菌株，其特征在于，ycac基因上下游融合片段的碱基序列如seq id no.2所示。
6.如权利要求1所述的通过限制吩嗪合成竞争途径促进吩嗪-1-羧酸生产的基因工程菌株，其特征在于，所述ycac基因敲除引物包括：ycac-f1、ycac-r1、ycac-f2、ycac-r2，序列分别如seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6所示。
7.如权利要求1所述的通过限制吩嗪合成竞争途径促进吩嗪-1-羧酸生产的基因工程菌株，其特征在于，敲除工程菌株qpca-8基因组中pabc基因的具体步骤包括：
8.如权利要求1所述的通过限制吩嗪合成竞争途径促进吩嗪-1-羧酸生产的基因工程菌株，其特征在于，pabc基因上下游融合片段的碱基序列如seq id no.8所示。
9.如权利要求1所述的通过限制吩嗪合成竞争途径促进吩嗪-1-羧酸生产的基因工程菌株，其特征在于，pabc基因敲除引物包括：pabc-f1、pabc-r1、pabc-f2、pabc-r2，序列分别如seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11、seq id no.12所示。
10.一种通过限制吩嗪合成竞争途径促进吩嗪-1-羧酸生产的方法，其特征在于，包括：
