本发明属于生物工程领域，特别涉及一种生产2-羟基吩嗪的绿针假单胞菌方法及其应用。
背景技术：
1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、2-羟基吩嗪(2-hydroxyphenazine, 2-oh-phz)对许多真菌及细菌均具有较强的拮抗作用，是一种应用潜力广阔的生物农药。然而，通过化学合成易产生有毒有害物质，利用生物合成的方法，则是产量很低。
3、发明人之前的研究（专利zl202011026637.x）公开了一种用于生产2-羟基吩嗪的工程菌株及应用。通过敲除负调控因子 psra及 pars的方式对绿针假单胞菌( pseudomonas chlororaphis) qlu-1进行改造得到生产2-羟基吩嗪的菌株qlu-1-3。但进一步研究发现：采用菌株qlu-1-3生产2-羟基吩嗪的产量仍有待提升。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本发明提供一种生产2-羟基吩嗪的绿针假单胞菌方法及其应用。本发明以专利zl202011026637.x中qlu-1-3为出发菌株，通过在基因组中敲除对吩嗪合成有抑制作用的 mdta、 gspm基因，使工程菌株的2-羟基吩嗪产量提高到156.3 mg/l和216.4mg/l，为后续利用绿针假单胞菌生产2-oh-phz奠定基础。
2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、本发明的第一个方面，提供了一种生产2-羟基吩嗪的绿针假单胞菌方法，包括：
4、以2-羟基吩嗪生产菌株qlu-1-3为出发菌株，敲除基因组中 mdta基因和/或 gspm基因，得到相应的基因工程菌株；
5、将所述基因工程菌株接种于发酵培养基中进行培养，生产2-羟基吩嗪；
6、所述2-羟基吩嗪生产菌株qlu-1-3以绿针假单胞菌 (pseudomonas chlororaphis)qlu-1为出发菌株，连续敲除负向调控基因 psra及 pars而得；
7、所述绿针假单胞菌qlu-1的保藏编号为cctccno：m2020108，已于专利zl202011026637.x中公开。
8、在一些实施方式中，所述 mdta基因的序列如seq id no.1所示。
9、在一些实施方式中，所述 gspm基因的序列如seq id no.7所示。
10、在一些实施方式中，所述敲除基因组中 mdta基因的具体步骤包括：
11、在已经测序的qlu-1基因组序列中搜索 mdta基因序列及其上下游序列，通过融合pcr的方法获得mdta-ud片段；
12、通过酶切连接技术将所述mdta-ud片段连接质粒pk18mobsacb，构建 mdta基因敲除质粒pk18-mdta-ud；
13、将所述 mdta基因敲除质粒pk18-mdta-ud导入大肠杆菌s17-1（λpir），再与2-羟基吩嗪生产菌株qlu-1-3进行双亲杂交培养，筛选阳性克隆，即得敲除 mdta基因的菌株qlu-1-3△m。
14、在一些实施方式中， mdta基因上下游融合片段的碱基序列如seq id no.2所示。
15、在一些实施方式中，所述 mdta基因敲除引物包括：mdta-f1、mdta-r1、mdta-f2、mdta-r2，序列分别如seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6所示。
16、在一些实施方式中，敲除基因组中 gspm基因的具体步骤包括：
17、在已经测序的qlu-1基因组序列中搜索 gspm基因序列及其上下游序列，通过融合pcr的方法获得 gspm-ud片段；
18、通过酶切连接技术将所述gspm-ud片段连接质粒pk18mobsacb，构建 gspm基因敲除质粒pk18-gspm-ud；
19、将所述 gspm基因敲除质粒pk18-gspm-ud导入大肠杆菌s17-1（λpir），再与菌株qlu-1-3△m进行双亲杂交培养，筛选阳性克隆，即得敲除 gspm基因的菌株qlu-1-3△mg。
20、在一些实施方式中， gspm基因上下游融合片段的碱基序列如seq id no.8所示。
21、在一些实施方式中， gspm基因敲除引物包括：gspm-f1、gspm-r1、gspm-f2、gspm-r2，序列分别如seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11、seq id no.12所示。
22、在一些实施方式中，所述发酵培养基可以是kb培养基。
23、本发明的第二个方面，提供了一种生产2-羟基吩嗪的基因工程菌株，所述工程菌株是敲除2-羟基吩嗪生产菌株qlu-1-3基因组中 mdta基因和/或 gspm基因而得；
24、所述2-羟基吩嗪生产菌株qlu-1-3以绿针假单胞菌( pseudomonas chlororaphis)qlu-1为出发菌株，连续敲除负向调控基因 psra及 pars而得；
25、所述绿针假单胞菌qlu-1的保藏编号为cctccno：m2020108。
26、本发明的第三个方面，提供了上述的基因工程菌株在生产2-羟基吩嗪中的应用。
27、本发明的有益效果
28、(1)本发明选取绿针假单胞菌中吩嗪合成的负调控因子，通过敲除，促使假单胞菌中2-羟基吩嗪产量提高。本发明以专利zl202011026637.x中2-羟基吩嗪生产菌株qlu-1-3为出发菌株，通过无痕敲除 mdta基因，获得工程菌株命名为qlu-1-3△m，经过发酵测产，发现qlu-1-3△m的2-羟基吩嗪产量提高到156.3 mg/l，本发明在qlu-1-3△m的基础上，敲掉 gspm基因，获得菌株qlu-1-3△mg，经过测产，其2-羟基吩嗪的产量提高到216.4 mg /l。
29、(2)本发明利用kb培养基发酵，产量达到216.4mg/l，大大提高了菌株的产能，为后续工程菌株的工业化提供了坚实基础。
1.一种生产2-羟基吩嗪的绿针假单胞菌方法，其特征在于，包括：
2.如权利要求1所述生产2-羟基吩嗪的绿针假单胞菌方法，其特征在于，所述mdta基因的序列如seq id no.1所示。
3.如权利要求1所述生产2-羟基吩嗪的绿针假单胞菌方法，其特征在于，所述gspm基因的序列如seq id no.7所示。
4.如权利要求1所述生产2-羟基吩嗪的绿针假单胞菌方法，其特征在于，所述敲除基因组中mdta基因的具体步骤包括：
5.如权利要求1所述生产2-羟基吩嗪的绿针假单胞菌方法，其特征在于，mdta基因上下游融合片段的碱基序列如seq id no.2所示。
6.如权利要求1所述生产2-羟基吩嗪的绿针假单胞菌方法，其特征在于，所述mdta基因敲除引物包括：mdta-f1、mdta-r1、mdta-f2、mdta-r2，序列分别如seq id no.3、seq idno.4、seq id no.5、seq id no.6所示。
7.如权利要求1所述生产2-羟基吩嗪的绿针假单胞菌方法，其特征在于，敲除基因组中gspm基因的具体步骤包括：
8.如权利要求1所述生产2-羟基吩嗪的绿针假单胞菌方法，其特征在于，gspm基因上下游融合片段的碱基序列如seq id no.8所示；
9.一种生产2-羟基吩嗪的基因工程菌株，其特征在于，所述工程菌株是敲除2-羟基吩嗪生产菌株qlu-1-3基因组中mdta基因和/或gspm基因而得；
10.权利要求9所述的基因工程菌株在生产2-羟基吩嗪中的应用。
