本发明属于香精香料、食品化学，具体涉及美拉德反应初级阶段中的一对同分异构体amadori重排产物与heyns重排产物的分析定量方法。
背景技术：
1、美拉德反应，又称非酶促褐变反应，是食物加工储藏过程中以氨基酸与还原糖为原料生成类黑素等风味物质的一系列化学反应的总称，该反应生成的多种风味物质相互作用直接影响着食品的特征风味，其终产物类黑素引发食品的色泽变化，因此可以说美拉德反应是影响消费者感官的关键因素。在美拉德反应的初级阶段，氨基酸、肽等含氨基的化合物与葡萄糖、果糖等还原糖，先发生席夫碱反应，再经过amadori或heyns重排得到amadori或heyns重排产物。这两种重排产物理化性质稳定，具有一定的抗氧化能力，易于储存。它们本身不具备完整的风味属性，但经过加工处理后能迅速形成理想风味，因此它们在香精香料、食品添加剂领域有着广泛应用的前景。
2、目前，amadori重排产物的相关领域受到大量研究者的广泛关注，但是它的同分异构体heyns重排产物却鲜有人研究。amadori重排产物是由氨基化合物与葡萄糖反应得来，heyns重排产物是由氨基化合物与果糖反应得到，二者具有相似的结构，相似的物理性质和化学性质，它们都是美拉德反应中间体。但是，已经有研究指出，heyns重排产物与amadori重排产物作为风味前体物质，经过相同的热处理加工后，产生的风味物质的种类和含量有着较大的差异，因此对heyns重排产物的研究同amadori重排产物一样重要。
3、现在大部分针对amadori重排产物的分析研究是利用高效液相色谱将不同氨基酸的amadori重排产物进行分离，随后用二级质谱检测器进行定性定量。但是他们都没有考虑amadori重排产物的同分异构体heyns重排产物，它们具有相同的相对分子质量，在二级质谱中有着相似的裂解规律，因此在之前的研究中，heyns重排产物全部被定性为amadori重排产物然后一起定量。也有研究者提出用二者的特征子离子进行定量，即该子离子在一种重排产物的二级质谱中存在而在另一种重排产物中无法检出。但文献中报道的特征子离子在本研究的实验中发现在两种重排产物中均能检出，只是在强度上有着较大差异。因此，用特征子离子对两种重排产物进行简单的定性定量也不是一种可靠的方案。
技术实现思路
1、针对现有技术中无法同时对amadori重排产物与heyns重排产物进行定性定量的问题，本发明旨在提供一种利用离子比率定量分析待测样品中amadori重排产物与heyns重排产物方法。
2、为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
3、一种利用离子比率定量分析amadori重排产物与heyns重排产物的方法，包括以下步骤：
4、s1、获取同浓度但不同重排产物比值的混合溶液中a1和a2的响应强度比值kx，建立不同重排产物比值与kx的标准曲线l1；获取不同浓度重排产物下a3的响应强度，建立重排产物浓度与a3的响应强度的标准曲线l2；
5、s2、参照步骤s1获取待测样品中a1、a2和a3的响应强度，并根据标准曲线l1和l2得到amadori与heyns重排产物的含量；
6、其中，a1、a2和a3为母离子的二级碎片离子， a1和a2中任一碎片离子在amadori重排产物中的响应强度与其在heyns重排产物中的响应强度的比值满足预设阈值1，且另一碎片离子在heyns重排产物中的响应强度与其在amadori重排产物中的响应强度的比值满足阈值1；a3在amadori与heyns重排产物中的响应强度相当。
7、发明人发现，在相同的质谱条件下，amadori重排产物和heyns重排产物各自的二级质谱碎片离子之间的强度比例，不会随着浓度的改变而改变；虽然两者的二级质谱碎片离子大体上是相似的，但由于两种化合物在结构上的差异，导致两者的部分碎片离子在同样的质谱参数下表现出的强度上有着较大差距。基于此，本发明提出了利用amadori重排产物与heyns重排产物各自子离子中，相对强度差距较大的一组子离子与二者的母离子作为目标离子对，通过计算两种离子对在质谱中强度的比率得到amadori重排产物与heyns重排产物混合物中两者的相对含量，随后利用两者共有的相同浓度相同条件下强度相当的离子对来计算二者总量，最后通过计算分别得出二者的含量。
8、在本发明方法中，步骤s1具体包括以下步骤：
9、基于amadori重排产物标准品和heyns重排产物标准品配制系列1待测液，检测系列1中的a1和a2，对测试结果进行积分处理，得到各待测液中a1和a2的响应强度比值kx；以amadori重排产物与heyns重排产物浓度的比值为横坐标，以kx为纵坐标，得到标准曲线l1；或以amadori重排产物与heyns重排产物浓度的比值为纵坐标，以kx为横坐标，得到标准曲线l1；
10、基于amadori重排产物标准品和heyns重排产物标准品配制系列2待测液，检测系列2中的a3，对测试结果进行积分处理，得到各待测液中a3的响应强度；以重排产物浓度为横坐标，以a3的响应强度为纵坐标，得到标准曲线l2；或以重排产物浓度为纵坐标，以a3的响应强度为横坐标，得到标准曲线l2。
11、其中，系列1待测液为保持amadori重排产物和heyns重排产物的总浓度不变而二者比例不同的混合溶液，系列2待测液为不同浓度的单一amadori重排产物溶液、或不同浓度的单一heyns重排产物溶液、或amadori重排产物和heyns重排产物的总浓度变化的混合溶液。
12、在本发明方法中，步骤s2具体包括以下步骤：
13、参照步骤s1获取待测样品中a1和a2的响应强度比值，结合标准曲线l1，计算得到待测样品中amadori重排产物与heyns重排产物相对含量；参照步骤s1获取待测样品中a3的响应强度，结合标准曲线l2，计算得到待测样品amadori重排产物与heyns重排产物的总含量；
14、根据上述相对含量和总含量，得到待测样品中amadori重排产物与heyns重排产物的绝对含量。
15、优选地，在本发明方法中，母离子为[m+h]+，其中m为amadori或heyns为重排产物。由于amadori与heyns重排产物都具有一个亚氨基（-nh-），故它们很容易在质谱中得到一个h+显示出[m+h]+的信号；因此，在本发明的一些实施例中，以[m+h]+为母离子，选择使用正离子模式对它们进行检测。
16、优选地，在本发明方法中，预设阈值1至少为5，具体包括但不限于6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18或19等。可以理解的是，在计算a1、a2在不同重排产物中的响应强度的比值时，是在同质谱条件且同浓度amadori重排产物和heyns重排产物下进行的。
17、更为优选地，所述比值为5-20；具体包括以下两种情形：
18、情形1，a1在amadori重排产物中的响应强度大于其在heyns重排产物中的响应强度且二者响应强度的比值为5-20，a2在heyns重排产物中的响应强度大于其在amadori重排产物中的响应强度且二者响应强度的比值为5-20；
19、情形2，a2在amadori重排产物中的响应强度大于其在heyns重排产物中的响应强度且二者响应强度的比值为5-20，a1在heyns重排产物中的响应强度大于其在amadori重排产物中的响应强度且二者响应强度的比值为5-20。
20、实验数据表表明，a1和a2的比值过小容易导致重排产物比例在0.4-0.6之间的数据准确性不足，而比值过大会导致重排产物比例在0-0.2或0.8-1之间的数据准确性不足。
21、优选地，在本发明方法中，a3在amadori与heyns重排产物中的响应强度相当是指a3在amadori重排产物与heyns重排产物中的响应强度的差值在10%以内，即可以是9%，8%，7%，6%，5%，4%，3%，2%，1%，0.5 %等；更为优选地，差值在5%以内。差值的具体计算公式为：或，其中为a3在amadori重排产物中的响应强度，为a3在heyns重排产物中的响应强度，且响应强度在相同质谱条件以及相同条件下获得。在实际检测过程中，由于amadori重排产物与heyns重排产物互为同分异构体，二者的结构相似度极高，满足a3要求的碎片离子很容易找到。
22、在本发明的一个实施例中，针对于组氨酸的amadori重排产物与heyns重排产物的定量分析时，母离子[m+h]+具体为318m/z，a1、a2选自138m/z、282m/z，a3为190m/z。
23、在本发明的另一个实施例中，针对于缬氨酸的amadori重排产物与heyns重排产物的定量分析时，母离子[m+h]+具体为280m/z，a1、a2选自172m/z、130m/z，a3为198m/z。
24、需要说明的是，本发明方法适用于所有氨基酸amadori重排产物与heyns重排产物的定量分析。
25、在本发明方法中，步骤s2中的待测样品可以为烟草；本发明的一个实施例中还提供了烟草样品的前处理方式，具体为：用甲醇水溶液提取烟草，离心取上清液，将上清液稀释至合适溶度即课利用本发明方法进行检测。
26、优选地，在本发明方法中，以高效液相色谱作为进样系统，以三重四极杆质谱作为检测器。
27、相对于现有技术，本发明的有益效果为：
28、（1）本发明能够较为准确地同时定量测量实际样品中的amadori重排产物与heyns重排产物，相对于利用特征离子对的定量结果更为合理。
29、（2）本发明提出的定量方法也可以应用到其它异构体的定性定量方案中，为难以分离的同分异构体的定量提供了新思路。
1.一种定量分析amadori与heyns重排产物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s2包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述母离子为[m+h]+，所述m为amadori或heyns为重排产物。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预设阈值1至少为5。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预设阈值2小于等于10%。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述amadori与heyns重排产物为组氨酸的amadori与heyns重排产物时，所述a1、a2选自138m/z、282m/z，所述a3为190m/z。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述amadori与heyns重排产物为缬氨酸的amadori与heyns重排产物时，所述a1、a2选自172m/z、130m/z，所述a3为198m/z。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品为烟草。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，以甲醇水溶液为提取剂对烟草进行前处理。
