本发明涉及一种可同时检测生殖支原体感染及其耐药基因位点突变的试剂盒，尤其涉及一种基于双重荧光信号介导的均相等温扩增技术，同时实现生殖支原体感染和耐药基因位点突变检测的试剂盒，属于生物工程。
背景技术：
1、生殖支原体（mycoplasma genitalium，mg）是一种没有细胞壁、能自行复制的最小原核细胞微生物。作为重要的性传播病原体，生殖支原体在女性人群中除能引起输卵管炎、子宫内膜炎、宫颈炎、盆腔炎等常见妇科疾病外，还可能引发不孕、早产、自发性流产、胎膜早破、胎儿宫内发育迟缓，甚至胎死宫内等一系列不良后果。有学者指出：生殖支原体感染会对输卵管产生不可逆转的永久损害。在他们进行的一项临床研究中发现，输卵管性不孕症患者中生殖支原体的感染率达33%。生殖支原体感染在男性人群可引起非淋菌性尿道炎、附睾炎，尤其在感染生殖器官后会导致精子质量及活动能力下降，从而引起少精子症、无精子症、继发性不育等。据统计，生殖支原体在性活跃人群中的感染率最高可达50%。因此，对生殖支原体感染的早期诊断和治疗与个体生殖健康息息相关。
2、传统的生殖支原体检测方法主要包括：分离培养法、免疫法和分子生物学方法。分离培养法是支原体检测的金标准，但因其在培养基上生长极为缓慢（培养周期>6个月）、培养条件苛刻、培养阳性率低、难以进行药敏实验等缺点，限制了通过微生物培养的方法实现对生殖支原体的检测。此外，由于支原体种属间易出现交叉反应、干扰因素多、对抗原和抗体纯度要求高等缺点，因此基于血清学的免疫检测策略也受到限制。目前，基于分子生物学的生殖支原体检测方法主要是以病原体的特异性dna或rrna作为检测靶标，利用聚合酶链式反应、等温扩增技术、高分辨融解曲线等常用的扩增检测技术，来确定检测样本中是否存在生殖支原体感染，如：上海仁度公司利用实时荧光核酸恒温扩增检测技术（simultaneousamplification and testing，sat）来实现对生殖支原体-rrna的高灵敏检测。相较于dna检测而言，rrna检测具有更高灵敏度和更显著临床指导意义。这主要归因于：一、病原体的dna遗传信息通常只有一至几拷贝，而rrna则高达104倍，极大提高了采样效率和检测灵敏度；二、rna检测更有利于疗效监测，其在病原体死亡后2-3天即完全降解，与临床相关性好，等同于微生物培养结果，因此，可以直接诊断活动性感染。
3、但无论是针对病原体本身的遗传物质dna还是转录产物rrna，现有的检测技术仅能明确有无生殖支原体感染，临床再进一步根据推荐的用药指南进行抗生素的经验性治疗。
4、在经验性治疗涉及的抗生素中，大环内酯类抗生素是支原体感染的一线治疗药物，然而，近年来随着抗生素用药场景的日益广泛和用药剂量的逐渐加大，该类抗生素的耐药问题愈加严重（耐药率常常高达47～58%），以大环内酯类抗生素作为一线治疗药物的治愈率显著下降。针对大环内酯类抗生素最常见的5种生殖支原体耐药突变类型分别是：a2058g，a2059g，a2058t，a2058c，a2059c。研究发现，大环内酯类抗生素治疗失败主要归因于mg核糖体上的23s rrna基因突变。23s rrna基因区域v58位的2058和2059位碱基突变可以导致核糖体结构改变，从而阻止大环内酯类抗生素与之结合。
5、生殖支原体高耐药率的发生表明，继续以往经验性抗生素的治疗不再是有效控制感染的明智之举，精准诊断辅以靶向基因精准用药的个体化治疗方案才是现阶段治疗感染的可靠手段。在诊断感染的同时又能明确是否存在耐药突变无疑是医生和患者最迫切希望的。但是调查和统计表明，目前，临床鲜有能同时实现生殖支原体感染及耐药基因突变的检测方法。在明确生殖支原体感染后再进行耐药突变的检测无疑会增加检测时长，从而延误病人的诊断和治疗。
技术实现思路
1、本发明旨在克服现有技术的不足，提出了一种可同时检测生殖支原体感染及其耐药基因位点突变的试剂盒。在本技术方案中，结合滚环扩增（rolling circleamplification，rca）技术的高扩增性能和染料法、分子信标法的双重荧光信号检测策略，构建了一种能在同一反应体系中、同时检测有无生殖支原体感染和是否存在耐药基因位点突变的试剂盒。其中，具体涉及的判断原理包括：
2、一、当生物样本中存在未发生耐药突变的生殖支原体 rrna时，以靶标（生殖支原体-rrna）为模板，环形探针（circle probe，cp）在t4 dna连接酶作用下，其5’端和3’端相互靠近，且连接成环。环形探针、引物（primer，p）、生殖支原体-rrna三者可通过碱基互补配对形成稳定的“三交联”结构，稳定结合的引物在phi29 dna聚合酶作用下，以环形探针为模板聚合延伸形成富含鸟嘌呤和与分子信标探针（molecular beacon，mb）序列互补的交叉串联重复单链dna产物，且随着聚合反应的进行，生殖支原体-rrna从环形探针上被替换下来，参与到后续环形探针的成环和扩增过程中，因此，可实现靶标的重复利用。而在交叉串联重复的单链dna产物上，富含鸟嘌呤的片段能与硫磺素 t（thioflavin t，tht）发生结构特异性识别，形成dna g4-硫磺素t复合物，在fam荧光通道即可检测到荧光信号；与分子信标探针序列互补的产物片段则与分子信标探针互补杂交，使其发生构型改变，cy5荧光通道信号得以恢复。故，此时可同时检测到dna g4-硫磺素t复合物和分子信标-分子信标互补链复合物的双重荧光信号；
3、二、当生物样本无生殖支原体感染时，环形探针和引物二者不能形成稳定的杂交结构，滚环扩增反应无法进行，因此，检测不到任何信号；
4、三、当生物样本中存在发生了耐药突变的生殖支原体-rrna时，虽然环形探针、引物、靶标三者可形成相对稳定的“三交联”结构，但是靶标突变位点的存在阻碍了环形探针在t4 dna连接酶作用下的连接成环。因此，只有引物不断聚合延伸产生大量富含鸟嘌呤的重复dna片段，并未启动完整滚环扩增的有序进行，此时，只能检测到来源于dna g4-硫磺素t复合物的单一荧光信号。
5、为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：
6、本技术方案提出：一种可同时检测生殖支原体感染及其耐药基因位点突变的试剂盒，包括环形探针、引物、分子信标探针、t4 dna连接酶、phi29 dna聚合酶、硫磺素t和dntp混合溶液；
7、其中，环形探针序列包括与分子信标探针互补的区ⅰ、与生殖支原体靶标互补的区ⅱ、富含胞嘧啶的区ⅲ、与引物互补的区ⅳ、与分子信标探针互补的区ⅴ和与生殖支原体靶标互补的区ⅵ，区ⅰ、区ⅱ、与区ⅲ、区ⅳ、区ⅴ和区ⅵ在环形探针序列上以5’端到3’端依次排列；以及，环形探针序列的3’端标记有羟基基团，5’端标记有磷酸基团。此处，“富含”是指本领域常规术语中的“富含”，其无法量化，而表示泛指；
8、引物序列：3’端与环形探针互补杂交，5’端与靶标互补；
9、分子信标探针：茎环部分序列与靶标一致，两侧臂一端标记荧光基团cy5，两臂另一端标记淬灭基团bhq2，且分子信标探针两侧臂区域各包含6个碱基，各碱基之间相互互补配对。
10、所述试剂盒检测标准为：
11、若检测为无荧光信号，呈阴性，则样本中无生殖支原体感染；
12、若检测为有dna g4-硫磺素t复合物的单一荧光信号，呈阳性，则样本中感染的生殖支原体存在耐药基因的位点突变；
13、若检测为有dna g4-硫磺素t复合物和分子信标-分子信标互补链复合物的双重荧光信号，呈阳性，则样本中感染的生殖支原体不存在耐药基因的位点突变。
14、进一步的，所述环形探针序列如seq id no .1所示；
15、其中，seq id no .1：
16、5’-tccgtcccgttgcgcccatctgaatcccaccctcccacccatcatcgcttgggtctt-3’。
17、进一步的，所述引物序列如seq id no .2所示；
18、其中，seq id no .2：为：5’-tacacattcgatga-3’。
19、进一步的，所述分子信标探针序列如seq id no .3所示；
20、其中，seq id no .3：5’- cgatgcatcgcttgggtctttccgtcgcatcg-3’。
21、在本技术方案中，涉及的试剂盒为定性检测试剂盒，其中，采用的仪器主要包括实时荧光pcr仪。对于本试剂盒的检测标准，涉及的荧光信号来源有两个：其一、是dna g4-硫磺素t复合物。硫磺素 t是一种水溶性荧光染料分子，它能特异性识别富含鸟嘌呤碱基的dna 或 rna链，并诱导其折叠形成g-四联体-硫磺素t复合物，使原本聚集态的硫磺素t分散形成单分子状态以恢复荧光信号。因其与g-四联体结合时的高特异性和强荧光响应（>700倍）而引起越来越多的关注。硫磺素t的激发波长为440nm，发射波长490nm，呈现绿色荧光信号，通过实时荧光pcr仪的fam通道即可采集到特异性荧光信号；其二、是分子信标-分子信标互补链复合物。标记在分子信标探针上的荧光基团cy5，呈现红色荧光信号，因此，通过分子信标探针的构型调节、利用实时荧光pcr仪的cy5通道，即可采集到目标信号。
22、采用本技术方案，带来的有益技术效果为：
23、一、本发明通过在检测生殖支原体感染的同时，可明确是否存在针对大环内酯类抗生素耐药的关键位点突变，这不仅能辅助临床医生及时诊断和病情监测，而且又能指导合理用药，避免抗生素的滥用，为病人及时、有效的个体化治疗提供理论参考。同时，为整合多学科、多技术发展简单实用、性能优良、普适性好的病原体核酸快速检测方法提供新思路；
24、二、采用本发明中的检测试剂盒，能实现在1.5小时内完成对同一份待检测样本同时进行生殖支原体感染及耐药基因位点突变的检测，可显著缩短生殖支原体感染的诊断周期，且能指导临床精准用药；
25、三、本发明克服了传统微生物方法难培养、耐药难诊断的实际缺陷和现有分子生物学手段对实验环境和仪器设备要求高、检测通量小等客观问题，为同时实现生殖支原体感染及耐药基因突变特异、高效分子诊断提供了有力技术支持。
1.一种可同时检测生殖支原体感染及其耐药基因位点突变的试剂盒，其特征在于，包括环形探针、引物、分子信标探针、t4 dna连接酶、phi29 dna聚合酶、硫磺素t和dntp混合溶液；
2.根据权利要求1所述的可同时检测生殖支原体感染及其耐药基因位点突变的试剂盒，其特征在于，依据的检测标准为：
3.根据权利要求1所述的可同时检测生殖支原体感染及其耐药基因位点突变的试剂盒，其特征在于，所述环形探针序列如seq id no .1所示。
4.根据权利要求1所述的可同时检测生殖支原体感染及其耐药基因位点突变的试剂盒，其特征在于，所述引物序列如seq id no .2所示。
5.根据权利要求1所述的可同时检测生殖支原体感染及其耐药基因位点突变的试剂盒，其特征在于，所述分子信标探针序列如seq id no .3所示。
