本公开涉及帽类似物和使用其的蛋白质表达方法，且更具体地说，涉及帽类似物、包含帽类似物的5'加帽mrna、包含5'加帽mrna的用于表达靶肽或蛋白质的医药组合物以及通过使用5'加帽mrna产生靶肽或蛋白质的方法等。
背景技术：
1、为了从dna遗传信息中表达功能上重要的特定蛋白质，需要在细胞核中进行转录(transcription)过程，其中从dna模板链合成具有互补序列的信使rna(messenger rna，mrna)。随后合成的mrna被转运出细胞核，且在细胞质中经历翻译(translation)过程，由核糖体用来合成特定蛋白质。
2、mrna经历转录后成熟过程(maturation process)以有效地翻译编码蛋白质。在这一过程期间，7-甲基鸟苷(7mg)通过5'端的三磷酸基团与mrna分子的5'端连接的过程称为5'加帽过程(5'capping process)。5'帽结构(称为5'帽0mrna结构)可保护mrna的5'端免受5'核酸外切酶的生物降解，且影响mrna从细胞核到细胞质的易位。确切来说，5'帽结构由真核翻译起始因子4e(eukaryotic translation initiation factor 4e，eif4e)识别，其通过形成翻译起始复合物在蛋白质表达中发挥重要作用。
3、为了使这种加帽mrna能够应用于临床，其必须具有其中通过5'-三磷酸链与7-甲基鸟苷连接的第一个核苷酸的2'羟基被甲基化的结构(cap1 mrna)。当应用未甲基化的cap0结构时，识别cap0结构的mda5(一种细胞内传感器蛋白)在具有cap0结构的外源(exogenous)mrna引入体内时识别2'羟基，且诱导免疫炎症反应，从而损害mrna与elf4e的结合，且因此抑制蛋白质表达。另一方面，2'oh甲基化的外源cap1 mrna由于不被mda5识别，引入体内时不会诱导免疫反应，且因此可能诱导相对较高的蛋白质表达，适合临床使用。
4、近年来，基于上述活性mrna的5'端的结构特性，体外mrna合成研究已在积极开展，特别是5'加帽方法也在不断研发。在体外mrna合成中，5'加帽可大致分为两种方法。常规加帽方法(conventional capping method)是在体外转录后通过处理参与5'加帽的酶(即被称为“加帽酶”的混合物)来获得5'端被7-甲基鸟苷加帽的结构(帽0)的方法。为了形成cap1或cap2 mrna结构，mrna必须另外用能够甲基化核苷酸的2'羟基的酶进行处理，例如牛痘mrna(核苷-2'-o)甲基转移酶。这种常规加帽方法的缺点是由于酶成本和处理次数而导致制备成本昂贵，且难以控制酶反应。
5、为了克服常规加帽方法的这些缺点，正在研究共转录加帽方法(co-transcriptional capping method)。共转录加帽方法是指在体外mrna合成期间同时引入化学合成的帽类似物，从而合成其中帽类似物构成5'端的mrna的方法。共转录加帽方法已经从第一代二聚体帽类似物(mcap(7mg(5')ppp(5')g))发展到第三代三核苷酸帽类似物(来自三联(trilink)的(7mg(3'ome)pppn(2'ome)pn)(美国专利第10,913,768号))，每一代都改进了上一代的缺点。虽然与常规加帽方法相比，mcap的生产成本较低，但其受限于5'帽0mrna结构，且具有当mcap在dna模板上形成碱基配对(base pairing)时与三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate，gtp)竞争的缺点。为了比gtp更有利地在dna模板上进行碱基配对，有必要添加4倍至10倍的gtp用量，这为增加生产成本的因素。另外，呈二核苷酸形式的mcap可能经历反向结合，导致双向转录起始，从而降低体外正向mrna合成的效率。
6、为了解决反转录起始的这一问题，研发了第二代帽类似物，防反向帽类似物(anti-reverse cap analog)(又名arca)(美国专利7,074,596)。arca为二聚体帽类似物，其结构为7mg(3'ome)pppg或7mg(2'ome)pppg，其中7-甲基鸟苷的2'或3'羟基由二聚体7mgpppg中的甲氧基取代，其防止帽类似物的反向结合，且因此完全阻断反转录起始rna(参见9:1108-1122(2003))。另外，已证实2'或3'羟基被化学修饰的arca与2'和3'均为羟基的帽类似物相比具有提高的蛋白质表达效率。无论位置如何，2'羟基和3'羟基的化学修饰均显示出同等水平的蛋白质表达效率。然而，第二代帽类似物并未解决与gtp竞争性碱基配对的问题。尽管mrna在反向方向上的产生受到抑制，但与gtp相比，仍存在与pppg 5'端产生mrna杂质(称为无帽(uncapped)mrna)或引入过量帽类似物的问题。另外，使用arca进行体外mrna合成具有由于不能合成帽1结构而诱导先天性免疫反应的缺点。
7、在三联(trilink)研发的第三代帽类似物的情况下，其具有至少三核苷酸的结构，且cap1结构(7mgpppn(2'ome)pn)可在不使用酶的情况下体外合成。另外，因为其比gtp多至少一个碱基，所以其可以在转录开始时与dna模板链更强烈地氢键结以进行碱基配对，并且因此可以在体外mrna合成期间降低帽类似物的输入量。当前商业化的(7mg(3'ome)pppa(2'ome)pg)为使7-甲基鸟苷的3'羟基甲基化的三核苷酸帽，且已展示出优于2',3'羟基帽(7mgpppa(2'ome)pg)的改进的蛋白质表达效率。
8、基于上述cleancap结构的商业化mrna疫苗(7mg(3'ome)pppa(2'ome)pg)包含来自辉瑞/biontech(pfizer/biontech)的bnt162b2。研发bnt162b2是为了应对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)引起的传染病，这是一种引发全球大流行病的rna病毒。使用cleancap作为关键原材料制作的bnt162b2难以满足应对全球covid-19大流行病的需求，且一度出现原材料供应短缺的情况。为了大量生产能够充分应对高传染性rna病毒传染病的mrna疫苗，需要快速且经济地生产和供应原材料，其中，必须进行各种额外研究和研发，以有效地制造且快速地供应帽类似物，其生产成本最高。
9、纵观三联目前商业化的三核苷酸帽类似物的制造过程，大致分为如下所示的六个主要过程(美国专利10,913,768)。
10、[反应1-1]
11、g(3'ome)→pg(3'ome)→im-pg(3'ome)→ppg(3'ome)→pp7mg(3'ome)→im-pp7mg(3'ome)+pn(2'ome)pn→7mg(3'ome)pppn(2'ome)pn
12、在反应1-1中，其中g是指鸟苷，7mg是指7-甲基鸟苷，n是指腺苷、胞苷、鸟苷以及尿苷中的任一个，p是指-p(＝o)o2-，me是指甲基，且im是指咪唑化物。此外，从细节来看，如果包含合成最终制造过程中使用的反应物pn(2'ome)pn的过程，那么必须进行至少10个步骤的漫长过程。
13、确切来说，当大量生产三联的帽类似物时，整个制造过程中增加生产成本和合成周期的主要因素是在制造过程的步骤之间必须进行的使用离子交换色谱(主要为deae树脂)的纯化过程。在纯化每一制造过程的中间物之后，柱纯化中使用的大量缓冲溶液(主要为碳酸氢三乙铵(triethylammonium bicarbonate，teab)缓冲液)必须在有机溶剂中蒸馏才能继续进行下一过程。由于pg(3'ome)、ppg(3'ome)、pp7mg(3'ome)、pn(2'ome)pn以及7mg(3'ome)pppn(2'ome)pn的生成过程的每一步骤都必须进行纯化，因此在整个制造过程中，总共需要5次离子交换柱纯化。确切来说，对于g(3'ome)的生产，有必要选择性地仅对鸟苷核苷的三个羟基中的3'-oh进行单醚化，且还有必要仅纯化产物当中的3'-单醚化产物，从而引起起始物质pg(3'ome)的制造成本高的问题。这一冗长过程、柱纯化以及缓冲溶液的蒸馏增加了制备帽类似物所需的时间和成本，降低了其经济可行性。
14、此外，为了制备作为制备arca和三联帽类似物的起始物质的3'-甲氧基鸟苷(g(3'ome))，仅经3'甲氧基取代的单醚物质可通过诱导2'和3'羟基上的甲基化反应来分离。作为实例，纵观arca发明中描述的3'-甲氧基鸟苷的制备过程，其分为如下所示的三个步骤(rna9:1108-1122(2003))。
15、[反应1-2]
16、
17、每一步骤必须进行快速色谱或dowex 1×2离子交换色谱，且每一步骤的产率低，导致难以大量生产且生产成本增加。近年来，已进行了研究及研发以提高3'-甲氧基鸟苷的合成效率，但制造过程延长，且分离经3'-甲氧基取代的单醚物质仍存在困难。这是增加合成帽类似物的原材料成本的主要因素。
18、[现有技术]
19、[专利文献]
20、(专利文献001)us 7,074,596
21、(专利文献002)us 10,913,768
22、[非专利文献]
23、(非专利文献001)rna9:1108-1122(2003)
技术实现思路
1、[技术问题]
2、一个方面提供一种帽类似物，其可提高5'-加帽mrna分子的体外合成效率，且可提高加帽mrna的蛋白质表达的效率，且实现帽类似物本身的经济生产。
3、另一方面提供一种制备用于制备帽类似物的中间物的方法。
4、另一方面提供一种用帽类似物进行5'-加帽的mrna。
5、另一方面提供一种利用帽类似物制备mrna的方法。
6、另一方面提供一种包含帽类似物的用于制备5'加帽mrna的组合物或试剂盒。
7、另一方面提供一种包含帽类似物的用于表达靶肽或蛋白质的医药组合物。
8、另一方面提供一种含有用帽类似物进行5'-加帽的mrna的细胞。
9、另一方面提供一种含有从用帽类似物进行5'-加帽的mrna翻译的蛋白质或肽的细胞。
10、[技术解决方案]
11、一个方面提供一种式1的化合物或其医药学上可接受的盐：
12、[式1]
13、
14、其中
15、n＝0、1或2；
16、r1和r2各自独立地为h或c(＝o)-r'，其中r1和r2中的至少一个为c(＝o)-r'，其中r'为c1至c6烷基或c1至c6烷氧基；
17、r3为甲氧基；
18、z和z'各自独立地为天然氮碱基。
19、另一方面提供一种水性组合物，其包含摩尔比为0.65±0.05:1的式1a的化合物和式1b的化合物：
20、[式1a]
21、
22、[式1b]
23、
24、此处，m3中的每一m独立地不存在，或为选自由na+、li+、nh4+以及k+组成的群组的一价阳离子或选自由mg2+、zn2+以及ca2+组成的群组的二价阳离子，其中选择m3以使得化合物为电中性的。
25、另一方面提供一种帽类似物，其包含以上式1的化合物。
26、另一方面提供一种用帽类似物进行5'-加帽的mrna。
27、另一方面提供一种制备mrna的方法，其包含在mrna合成期间并入帽类似物。
28、另一方面提供一种包含帽类似物的用于制备5'加帽mrna的组合物或试剂盒。
29、另一方面提供一种用于表达所需肽或蛋白质的医药组合物，其包含用帽类似物进行5'-加帽的mrna和医药学上可接受的载体。
30、另一方面提供一种包含用帽类似物进行5'-加帽的mrna的细胞。
31、另一方面提供一种含有从用帽类似物进行5'-加帽的mrna翻译的蛋白质或肽的细胞。
32、另一方面提供一种制备式6的化合物或其盐的方法，其包括以下步骤：
33、通过使以下式2的化合物或其盐与以下式3的化合物在碱性条件下在水相中反应来制备式4的化合物或其盐；以及
34、使式4的化合物或其盐与式5的化合物在ph 1.5至4.5条件下用原位方法反应：
35、[式2]
36、
37、[式3]
38、
39、[式4]
40、
41、[式5]
42、
43、[式6]
44、
45、在以上式中，r是指c1至c6烷基或c1至c6烷氧基，且r1和r2各自独立地为h或c(＝o)-r'，其中r1和r2中的一个为h且另一个为c(＝o)-r。
46、[有利效应]
47、根据一方面的帽类似物(例如三联的三核苷酸帽类似物(7mg(3'ome)pppa(2'ome)pg))并不需要在特定位置处选择性地引入保护基团，且并不需要纯化选择性引入的化合物，不需要昂贵起始物质(例如3'-甲氧基鸟苷(3'-methoxy guanosine))，且具有能够简化制造过程的优势，由此改进合成的效率和经济性，同时在加帽mrna时实现加帽mrna的极佳表达效率。
48、因此，帽类似物在功能和生产成本方面具有极佳优势，并且包含本公开的帽类似物的mrna可非常适用于治疗或预防哺乳动物(包含人类)的疾病。
1.一种以下式1的化合物，或其医药学上可接受的盐：
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有以下式1a的结构：
3.根据权利要求2所述的化合物，其中r'为c2至c6烷基或c2至c6烷氧基。
4.根据权利要求2所述的化合物，其中所述一价阳离子选自由na、li、nh4+以及k组成的群组，且所述二价阳离子选自由mg2+、zn2+以及ca2+组成的群组。
5.根据权利要求2所述的化合物，其中z和z'各自独立地选自由鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶以及尿嘧啶组成的群组。
6.根据权利要求1所述的化合物，选自由下式的化合物或其医药学上可接受的盐组成的群组：
7.一种水性组合物，包括摩尔比为0.65±0.05:1的以下式1a的化合物和式1b的化合物：
8.根据权利要求7所述的水性组合物，其中所述m3中的每一m皆为na+。
9.根据权利要求7所述的水性组合物，其中所述水性组合物的ph为1.0至8.0。
10.一种帽类似物，包括如权利要求1至9中任一项所定义的化合物。
11.一种mrna，用如权利要求10所述的帽类似物进行5'-加帽。
12.一种用于制备5'加帽mrna的组合物或试剂盒，包括如权利要求10所述的帽类似物。
13.一种用于表达所关注的肽或蛋白质的医药组合物，包括用如权利要求10所述的帽类似物进行5'-加帽的mrna和医药学上可接受的载体。
14.一种制备式6的化合物或其盐的方法，包括以下步骤：通过使以下式2的化合物或其盐与以下式3的化合物在碱性条件下在水相中反应来制备式4的化合物或其盐；以及
15.一种制备式8的化合物或其盐的方法，包括以下步骤：通过使式6的化合物或其盐与咪唑反应来制备式7的化合物或其盐；以及
