本公开涉及新型阴离子聚合物，其用作带正电蛋白质或基于聚阳离子的非病毒载体的屏蔽(shielding)以实现将蛋白质或包括核酸在内的活性成分递送到细胞。
背景技术：
1、将活性成分递送到位于细胞内的靶位点需要适当的递送载剂，其提供足够的保护并允许活性成分有效地递送到体内的特定组织。不过，递送载剂必须克服不同的细胞外和细胞内屏障才能到达其在细胞内的靶位点。尽管与非病毒载体相比，病毒载体对于基因递送是有效的，但其使用伴随着若干风险，包括毒性、免疫原性和遗传物质货物大小的限制。非病毒载体通常更安全且更便于大规模生产，但其转染效率相对较低。
2、阳离子聚合物作为非病毒合成载剂用于将活性成分，更具体地核酸递送到靶细胞的用途引起了相当大的关注。
3、阳离子聚合物，如聚乙烯亚胺(pei)、聚(β-氨基酯)、聚酰氨基胺、壳聚糖和其它聚胺如pasp(det)，能够形成携带和保护活性成分(尤其是核酸)的纳米颗粒(基于聚阳离子的非病毒载体)。因此，这些阳离子聚合物可携带活性成分并在其进入细胞膜并最终到达细胞核时保护该活性成分。
4、不过，基于聚阳离子的非病毒载体开发受限的一个主要原因在于需要阳离子聚合物在递送过程的不同阶段显示不同的功能。例如，载体可能需要有高胺密度以克服内体膜屏障，因为纳米颗粒的质子化电势可能会导致内体失稳，从而允许在细胞质介质中释放。相反，纳米颗粒或蛋白质带正电性质可能会导致在血流中聚集并与带负电荷血清组分非特异性相互作用，从而在毛细血管中产生血栓或阻碍蛋白质发挥其生理功能。这种带高正电颗粒(即多聚体(polyplexes)或蛋白质)还有引发高细胞毒性和过度免疫反应的风险。此外，这些带正电纳米颗粒还可能会导致严重的血清抑制并会迅速从血液中清除，这会阻碍其在体内应用。
5、解决这些问题的公知的尝试是通过用聚乙二醇(peg)覆盖纳米颗粒的表面来屏蔽正电荷。然而，在多聚体的情况下，共价结合的peg的存在将显著降低转染效率，因为纳米颗粒的中性表面会降低细胞摄取效率，或者在蛋白质的情况下，由于活性位点空间位阻，也可能会导致活性丧失，因为纳米颗粒的中性表面会降低细胞摄取效率。此外，还公知peg会产生抗peg抗体，这可能会导致免疫原性和过敏反应。
6、因此，从本领域已知的情况来看，仍然需要找到克服上述问题的新屏蔽策略。
技术实现思路
1、因此，本发明人设计了新型阴离子聚合物，其用作带正电蛋白质或基于聚阳离子的非病毒载体的屏蔽以实现将蛋白质或包括核酸在内的活性成分递送到细胞，细胞毒性低、效率高，具有充足的血浆半衰期时间、增强的渗透性和保持性、水溶液中的高溶解性、因在血流中有限或甚至完全抑制的聚集问题具有高稳定性、潜在的不同细胞和组织向性。
2、在本发明的环境中，术语“带阴离子(anionically charged)聚合物”、“带聚阴离子(polyanionically charged)聚合物”、“阴离子聚合物”或等同物是指包含天然或非天然阴离子氨基酸的聚合物，这种氨基酸在碱性或生理ph下包含净负电荷，并且可以是例如谷氨酸或天冬氨酸，或其组合，即一旦失去氢离子就呈阴离子性的氨基酸，但其还包括一旦获得氢离子就将呈中性的阴离子基团。侧链中具有阴离子基团的多肽还包括通过具有酸性侧链的已知氨基酸(例如谷氨酸、天冬氨酸)的肽键获得的多肽衍生物，以及通过任意氨基酸的肽键和后续在侧链中取代以具有带阴离子基团获得的多肽。
3、如本文使用的术语“非共价键”是指不涉及电子共享，而涉及分子之间电磁相互作用的更分散变异的键。非共价键可分为各种类别，如静电相互作用、π-相互作用、范德华力、氢键合和疏水效应。
4、因此，本发明的第一方面涉及包含下式(ia)或(ib)的阴离子聚合物、其药学上可接受的盐，或式(ia)或(ib)化合物的或任意其药学上可接受的盐的任意立体异构体或立体异构体的混合物，包括同聚多肽或无规或嵌段或接枝共多肽
5、
6、其中y选自-co-(ch2)p-co-和-co-(ch2)q-s-s-(ch2)r-co-；
7、z选自单键、-co-(ch2)q-s-s-(ch2)r-nh-(r5)z-、-co-(ch2)p-nh-(r5)z-、-co-(ch2)p-co-nh-(ch2)q-s-s-(ch2)r-nh-(r5)z-和-(r5)z-；
8、o是选自1至2的整数；
9、p、q和r各自独立地是选自1-6的整数；
10、r5是无规或嵌段共聚物，其包括选自(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)和(ix)的至少两个不同的重复单元：
11、
12、a、b、c、d、e、f、g和h各自独立地是选自0至20的整数；前提是a、b、c、d、e、f、g和h中的至少两个不同于0；
13、z是选自5至100的整数；
14、x选自n、s和o；
15、r1选自h和(c1-c6)烷基，前提是当x是o时，r1不存在；
16、r3和r4各自独立地选自h和-ch3；
17、m是选自5至250的整数；
18、n是选自3-200的整数；
19、前提是m∶n之间的比例范围在1∶8至30∶1；
20、r2选自：h，和选自(x)、(xi)、(xii)和(xiii)的自由基
21、
22、其中s、t、u和v各自独立地是选自1至4的整数；
23、其中“/”指示该符号两侧由方括号定义的单体重复单元的顺序次序(sequentialorder)是任意的，因此尽管式ia和ib中由方括号定义的重复单元为便于描述而以具体顺序显示，但重复单元可以以任意次序存在并且重复单元可以是嵌段或无规存在的；
24、其中在式ib中，r5的式(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)和(ix)的各自重复单元和用带n整数的方括号表示的重复单元的顺序次序可以是嵌段或无规存在的；
25、a和a’各自独立地选自h、oh、直链或支链-(c1-c6)烷基、直链或支链-co(c1-c6)烷基、-(cs-c10)芳基、-(c5-c10)杂芳基、-(c6-c10)芳烷基、-(c1-c6)烷基-o-(c5-c10)芳基、-(c5-c10)杂环烷基、-(c1-c10)烷氧基、-(c6-c10)芳氧基、-(c6-c10)芳烷氧基、-(c5-c10)杂芳烷氧基、-(c1-c10)烷基-o-(c6-c10)芳氧基、胺保护基、天然或非天然α氨基酸、羧基保护基、标记剂或显像剂和细胞靶向剂；
26、作为a和a’中的每一个，其独立地被选自下列的一个或多个基团任选地取代：-oh、卤素、-cf3、-nh2、-nh-(c1-c4)烷基、-nr6r7、-nh-co-(c1-c6)烷基、-(c1-c6)烷基、-no2、-n3、-co-(c1-c6)烷基、-co-o-(c1-c6)烷基、-so3h、-so2nh2、-so2-n((c1-c6)烷基)2、-cooh、conh2和-con((c1-c6)烷基)2；
27、r6和r7独立地选自h、-(c1-c4)烷基和胺保护基。
28、根据本发明的第二方面，提供聚合物复合物，其包括：
29、a)阳离子聚合物，其与至少一种活性剂，优选选自药物活性剂、兽医活性剂、化妆品活性剂、诊断活性剂、核酸、肽、抗体、适配体、蛋白质及其混合物共价或静电结合；其中阳离子聚合物和所述至少一种活性剂形成带正电纳米颗粒；和
30、b)至少一种如本文定义的式(ia)或(ib)阴离子聚合物，其与纳米颗粒静电相互作用。
31、根据本发明的另一方面，提供基于蛋白质的复合物，其包括：
32、a)带正电蛋白质，和
33、b)至少一种如本文定义的式(ia)或(ib)阴离子聚合物，其与蛋白质静电相互作用；
34、或者可选地
35、a’)带阴离子蛋白质，其与阳离子聚合物共价或静电结合，形成带正电纳米颗粒，和
36、b’)至少一种根据权利要求1-7中任一项的式(ia)或(ib)阴离子聚合物，其与a’)的带正电纳米颗粒静电相互作用。
37、根据本发明的第四方面，提供组合物，其包括至少一种如本文定义的聚合物复合物或基于蛋白质的复合物，连同一种或多种适当的(例如药学上、诊断上、兽医或化妆品上)可接受的赋形剂或载剂。
38、另一方面，本发明涉及如本文定义的聚合物复合物、基于蛋白质的复合物或药物组合物，其用作药物。
39、可选地，此方面可配制(formulated)成用于医药中的治疗产品，其是如本文定义的聚合物复合物，或者可选地如本文定义的基于蛋白质的复合物，或者可选地如本文定义的组合物。
40、本发明的另一方面涉及如本文定义的聚合物复合物或包含其的药物组合物
41、(i)用作将至少一种活性剂转染入细胞的转染试剂；或
42、(ii)用于体内或离体生产编码重组蛋白、肽或抗体的生物制剂(biologics)，或用于生产重组病毒；或
43、(iii)用作针对病毒感染的治疗性或预防性疫苗或用作针对癌症的治疗性疫苗；或
44、(iv)用于基因组工程、用于细胞重编程、用于分化细胞或用于基因编辑。
45、本发明的另一个方面涉及如本文定义的基于蛋白质的复合物或包含其的药物组合物，用于基于蛋白质的疗法；尤其用作针对病毒感染的治疗性或预防性基于蛋白质的疫苗或用作针对癌症的治疗性基于蛋白质的疫苗。
46、本发明还提供装置，其可适于例如将活性剂递送到细胞、组织或胞外空间中，优选核酸或蛋白质；装置包括如本文定义的聚合物复合物或包含其的组合物。此方面还可配制成用于将活性剂(例如核酸或蛋白质)递送到细胞、组织或胞外空间的方法中的装置，其中装置包括如本文定义的聚合物复合物、如本文定义的基于蛋白质的复合物或如本文定义的包含其的组合物。
47、如本领域普通技术人员将认识到的，用于将活性剂递送到细胞中的适当的装置将取决于所选择的组合物或药物组合物的制剂和/或期望施用部位。例如，如果组合物的制剂适于注射到对象体内，则装置可以是注射器。举另一个实例，如果期望施用部位是细胞培养基，则装置可以是无菌移液器。再举一个实例，如果期望施用部位是静脉或动脉，则装置可以是移植物。再举一个实例，如果期望施用部位是皮下或器官特异性贮库(depot)，则装置可以是外科植入物。
48、本发明的递送装置可用于治疗(基因疗法)，其中将预期核酸引入引起各种疾病中任一种的细胞中。
49、根据本发明的另一个方面，提供将蛋白质或核酸递送到靶细胞、组织或胞外空间中的方法，包括将含有如本文定义的聚合物复合物、基于蛋白质的复合物或组合物的溶液施用于动物，包括人，使得可将复合物引入靶细胞、组织或胞外空间中。对于携带在胞内空间中发挥其作用的活性成分的聚合物复合物或基于蛋白质的复合物，转运是通过下列进行的：细胞内化，通过任意内化机制将复合物转移到细胞质；解离细胞内的复合物；和将蛋白质或活性成分释放到细胞质中。对于那些在胞外空间发挥其作用的蛋白质复合物而言，没有内在化的目标或要求。
50、此方面可配制成如本文公开的聚合物复合物、基于蛋白质的复合物或组合物在将核酸递送到靶细胞中的递送方法中的用途，递送方法包括使含有如本文定义的聚合物复合物、基于蛋白质的复合物或组合物的溶液与靶细胞、组织或胞外空间接触，使得可将复合物引入靶细胞、组织或胞外空间中；将复合物从内体转移到细胞质；解离细胞中的复合物；和将核酸释放到细胞质中。
51、可选地，此方面可配制成如本文定义的聚合物复合物、如本文定义的基于蛋白质的复合物或如本文定义的组合物，其用于将核酸或蛋白质递送到靶细胞、组织或胞外空间中的方法中，方法包括使含有如本文定义的聚合物复合物、如本文定义的基于蛋白质的复合物或如本文定义的组合物的溶液与靶细胞接触，使得可将复合物引入靶细胞、组织或胞外空间中；将复合物从内体转移到细胞质；解离细胞中的复合物；和将核酸或蛋白质释放到细胞质中。
52、另一方面涉及转染细胞的方法，包括使细胞与如本文定义的聚合物复合物、如本文定义的基于蛋白质的复合物或如本文定义的组合物接触。
53、另一方面，本公开涉及用于合成本公开第一方面或其任意实施方式的式(ia)或(ib)化合物的方法，方法总体上包括聚合本身已知的受保护或未受保护氨基酸的n-羧基酸酐(nca)以生产聚(氨基酸)，或受保护的聚氨基酸酯、氨基甲酸酯、s-烷基磺酰基或三氟乙酰基衍生物。然后，应通过本领域技术人员公知的方法进行脱保护步骤或硫醇交换。可通过改变相应嵌段或无规共聚物的比例，按期望比例引入重复单元中存在的不同自由基。
54、根据此方面，涉及用于合成本公开第一方面或其任意实施方式的式(i)化合物的方法，方法包括：
55、i)使引发剂的胺或四氟硼酸盐或三氟乙酸铵盐形式
56、i.1)与适当的n-羧基酸酐(nca)反应；可选地，使步骤i)的引发剂的胺或四氟硼酸盐或三氟乙酸铵盐形式与适当的n-羧基酸酐按序列方式反应以获得嵌段共聚物；
57、i.2)可选地，使步骤i)的引发剂的胺或四氟硼酸盐或三氟乙酸铵盐形式与适当的nca混合物按统计方式反应以获得无规共聚物；
58、ii)任选地，使n-末端位置的胺基与胺反应性基团反应以引入r1；
59、iii)任选地，正交去除氨基酸侧链保护基；
60、iv)任选地，使侧链末端位置的胺、硫醇、二硫化物、s-烷基磺酰基或羧酸基与胺或羧酸反应性基团反应以在r2中引入结构延伸(architectural extension)、缀合(conjugation)、标记(labelling)或屏蔽；
61、v)任选地通过分馏、沉淀、超滤、透析、尺寸排阻色谱法、亲和层析或切向流过滤纯化步骤i)、ii)或iii)中获得的产物。
62、上述步骤i)可包括：a)氨基酸n-羧基酸酐(nca)单体的开环聚合——通过使引发剂的胺或四氟硼酸盐或三氟乙酸铵盐形式与所选nca反应，其中单体/引发剂之比允许对聚合度(dp)的控制；b)序列聚合，其中嵌段共聚多肽是在聚合反应a’)之后按序列方式——使第一nca单体消耗并且在加入下一单体以构建后续多肽嵌段之前可纯化或不纯化所得产物——制备的；或c)统计聚合a’)，其中无规共聚多肽是在聚合反应之后按统计方式——在通过加入引发剂的胺或四氟硼酸盐或三氟乙酸铵盐形式开始聚合之前混合所有nca单体——制备的。
63、上述步骤ii)对应于封端，其中使n-末端位置的胺基与胺反应性基团反应以引入r1。
64、上述步骤iii)对应于交换反应或脱保护，其中氨基酸侧链根据保护基被正交地去除。
65、步骤iv)对应于缀合，通过氯乙酰化、甲基化、硫醇交换、亲核取代或肽偶联反应，按序列方式(如果需要)使侧链末端位置的胺或羧酸基反应获得屏蔽部分。
66、根据本发明的另一方面，提供用于制备结构上不同于如本文定义的式i化合物的化合物的方法，包括以下步骤：
67、i.使用如本文定义的式i化合物作为起始化合物；
68、ii.对步骤(i)的化合物进行结构改变以获得结构上不同于式i化合物的化合物。
69、在本发明的另一方面中，提供如本文定义的式i化合物在制备结构上不同于式i化合物的化合物中的用途。
1.式(ia)或(ib)阴离子聚合物、其药学上可接受的盐，或式(ia)或(ib)化合物的或任意其药学上可接受的盐的任意立体异构体或立体异构体的混合物，包括同聚多肽或无规或嵌段或接枝共多肽
2.根据权利要求1所述的阴离子聚合物，其中m是选自20至160的整数，并且n是选自4至100的整数；前提是m∶n之间的比例范围为1∶5至10∶1。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的阴离子聚合物，其是式(ia)或(ib)阴离子聚合物，r3是-ch3；并且r2是h。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的阴离子聚合物，其是式(ib)阴离子聚合物，其中z是单键；r2选自：h，和选自(x)、(xi)、(xii)和(xiii)的自由基；并且r3是-ch3。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的阴离子聚合物，其中所述阴离子聚合物是式ib阴离子聚合物；z选自-co-(ch2)q-s-s-(ch2)r-nh-(r5)z-、-co-(ch2)p-nh-(r5)z-、-co-(ch2)p-co-nh-(ch2)q-s-s-(ch2)r-nh-(r5)z-和-(r5)z-；并且r5是无规或嵌段共聚物，其包括选自(iii)、(vi)、(viii)和(ix)的至少2个重复单元；并且其中c、e、g和h独立地是选自1至20的整数；并且z是选自5-35的整数。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的阴离子聚合物，其是式(ia)阴离子聚合物；r2选自h，和选自(x)和(xii)的自由基；并且r3是-ch3。
7.根据权利要求6所述的阴离子聚合物，其中y是-co-(ch2)p-co-；r2选自h，和选自(x)和(xii)的自由基；r3和r4是h；m是选自20至160的整数；n是选自4-100的整数；前提是m∶n之间的比例范围为1∶5至10∶1。
8.聚合物复合物，其包括：
9.根据权利要求8所述的聚合物复合物，其中所述至少一种活性剂选自低分子量药物、肽、蛋白质、抗体、核酸、适配体及其组合。
10.根据权利要求8-9中任一项所述的聚合物复合物，其中所述核酸选自dna/rna杂合体、短干扰rna(sirna)、微小rna(mirna)、sgrna、供体dna、自我扩增/复制rna、环状rna(orna)、质粒dna(pdna)、封闭-线性dna(cldna)、短发夹rna(shrna)、信使rna(mrna)和反义rna(arna)、信使rna(mrna)、crispr指导rna、反义核酸、诱杀核酸、适配体和核酶。
11.根据权利要求10所述的聚合物复合物，其中所述核酸是cldna。
12.基于蛋白质的复合物，其包括：
13.组合物，其包括至少一种权利要求8-11中的任一项中定义的聚合物复合物或至少一种权利要求12中定义的基于蛋白质的复合物，连同一种或多种药学上、诊断上、兽医或化妆品上可接受的赋形剂或载剂。
14.用于医药中的治疗产品，其是：
15.装置，其用于将核酸或蛋白质递送到细胞、组织或胞外空间中的方法中，其中所述装置包括根据权利要求8-11中任一项所述的聚合物复合物、根据权利要求12所述的基于蛋白质的复合物或根据权利要求13所述的含其的组合物。
16.根据权利要求8-11中任一项所述的聚合物复合物、根据权利要求12所述的基于蛋白质的复合物或根据权利要求13所述的药物组合物，其用于将核酸或蛋白质递送到靶细胞、组织或胞外空间中的方法中，所述方法包括使含有根据权利要求8-11中任一项所述的聚合物复合物、根据权利要求12所述的基于蛋白质的复合物或根据权利要求13所述的药物组合物的溶液与所述靶细胞、组织或胞外空间接触，使得能够将所述复合物引入所述靶细胞、组织或胞外空间中；将所述复合物从内体转移到细胞质；解离所述细胞中的所述复合物;和将所述核酸或蛋白质释放到所述细胞质中。
17.转染细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与根据权利要求8-11中任一项所述的聚合物复合物、根据权利要求12所述的基于蛋白质的复合物接触。
