本发明涉及一种斜生栅藻pex11-2，具体涉及一种斜生栅藻pex11-2构建过表达藻株在斜生栅藻脂质积累及盐胁迫响应中的应用。
背景技术：
1、斜生栅藻，绿藻门栅藻属，是淡水中常见的浮游藻类，能够进行光能自养、混合营养或异养生长，在异养条件下短时间内即可达到极高的生物量。其形状一般为纺锤形或椭圆形，具有生长速度快、培养条件相对简单、生物量高、产脂率高等优点。此外，斜生栅藻在废水中可快速生长，具有很高的营养去除效率。
2、斜生栅藻富含油脂是用于生物燃料生产的合适藻种。目前斜生栅藻脂质相关研究主要集中在发酵条件优化、培养基优化、营养缺陷等方面。通过优化培养基中c、n、p源可提高斜生栅藻的生物量及脂肪酸合成水平，斜生栅藻在利用葡萄糖-木糖混合碳源进行培养时，其生物量有所增加，油脂含量提高了3.8％。培养基中甘蔗糖蜜的添加可刺激生物量和脂肪酸含量，在甘蔗糖蜜的32、65和73g/l条件下，脂肪酸生产率分别比对照水平高出3％、5％和1％。氮磷缺乏能显著提高栅藻细胞中脂质的积累，磷缺乏条件下，脂质含量提高了20.2％；氮缺乏条件下，脂质积累增加了2.27倍，脂肪酸含量增加了54％，但其生长受到抑制、生物量降低，导致产脂率下降。进一步优化氮磷含量可以提高栅藻油脂产量，氮浓度为25mg/l时，产量为160mg/l；磷浓度为2mg/l时，产量为90mg/l。
3、污水环境对于微藻的生长是一种逆境，斜生栅藻作为废水处理的良好候选者，具有较强的逆境生存能力。用含有高铵态氮的养鸡场废水和乙酸钠培养基混合营养培养斜生栅藻，其生物量可达2.18g/l，脂质含量高达50.22％，同时废水中总氮(tn)，总铵氮(tan)，总磷酸盐(tp)，生物需氧量(bod)和化学需氧量(cod)的去除率分别达到80％、68％、82％、86％、89％。用未经消毒的生活污水进行培养，污水中总磷浓度可有效去除97％以上，还观察到总氮(tn)的高去除率(超过90％)，且随着培养时间的延长斜生栅藻脂质产量显著增加，同时对生活废水环境具有良好的适应性[20]。高浓度的硒会危害环境，因此从废物流中去除硒非常重要，研究发现斜生栅藻在有效去除污水中的无机氮、无机磷、cod等的同时对废水中硒的去除高达52％。综上，斜生栅藻可以在净化污水的同时产生微藻油等具有较高经济效益的产品，是作为工业生产的优良藻种。
4、大规模培养方面，特别是水耗大是一大难题，利用生活废水和工业废水培养藻可以极大地缓解这个问题，利用含有营养成分的废水(来自其它行业、农业或城市用水)培养微藻，不仅可以大大降低微藻培养成本，还可以同时去除废水中的氮、磷，降解有机物和吸附重金属，为废水处理提供了更具环境效益和社会效益的方法[8]。将微藻培养和废气处理结合不仅能降低微藻的培养成本，也为当前的温室气体减排策略提供了一个很有前景的解决方案。利用废水、废气培养微藻可实现固碳、废水废气处理、生物燃料生产、化学品供给耦合，同时通过根据微藻特性优化培养条件来提升微藻培养效率。但是废水环境往往对于微藻的生存是一大挑战，因此，选育具有工厂化应用特性的高产优质抗逆的藻种，降低规模化培养成本是微藻产业中亟待解决的问题。
5、同时三酰基甘油(tag)是应激条件下许多藻类细胞中最常见的脂质。在不利的环境或胁迫条件下，许多藻类改变了其脂质生物合成途径，形成和积累中性脂质(主要以tag的形式)作为碳和能量的储存形式[23]。由于这也是用于生产液体生物燃料的主要脂质成分，因此微藻中的tag生物合成途径是脂质合成的重点。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种斜生栅藻pex11-2及其过表达藻株构建方法及其应用，本发明选取了斜生栅藻pex11家族中的pex11-2构建过表达藻株探究pex11在斜生栅藻脂质积累及盐胁迫响应中的潜在作用。结果表明，pex11-2定位在过氧化物酶体膜上且过表达在斜生栅藻脂质积累中发挥着积极作用，可通过调节活性氧(ros)水平、脂质合成相关基因的表达以及碳前体的重新分配促进微藻脂质的积累。此外，pex11-2过表达会抑制脂滴参与质膜重组及细胞分裂从而降低斜生栅藻对于盐胁迫的耐受性，总之这些发现证明了pex11基因在微藻脂质代谢以及盐胁迫响应中具有重要作用，可为藻类脂质生产应用研究和工程发展提供新思路。
2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
3、一种斜生栅藻pex11-2，其特征在于，斜生栅藻无参转录组测序结果中通过保守序列调取获得pex11的序列命名为pex11-2，pex11-2共有239个氨基酸，其蛋白序列为：
4、mskgdtldktiaflqkregidktlkivrytsrliaavsppgsdtrkrfdalqssvgtsrkayrlgkflqgvdalrrmrlrcsslallelvayagegtyyfldqflwlmkagflpkhqekavakasawaevlgymgsialschklqqlniqeaalarklealmkdeqdkqcidggllrqlqllrsarllrlalicqdladsmtainditegrvrgfnhpvalscagllsaavstykywka。
5、所述的一种斜生栅藻pex11-2，其特征在于，其cds序列为：
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18、所述的一种斜生栅藻pex11-2，其特征在于，其mrna序列为：
19、ggttcggaaccaaacttcaacgcattcacgcttctttcagctgatagcggaagttctgtgagcatccgtcactgttctgcacccgtaatactgttgctgtgttgatttatcgagctcataatcattctcattgttgatggctgtgctgatcagtagctagaactggagaagctagagctgcagcagcaacgatgagtaaaggcgacactctcgacaagacaatagcattcctacaaaagcgtgaaggaatcgacaagacactgaaaatagtgcgctacacttcgcgcctcatagcagcagtcagcccaccaggcagtgacaccagaaaacgcttcgatgcactgcaatctagtgtgggcaccagcaggaaggcgtaccggctgggcaagttcctgcagggcgtggacgcgctgcggcgcatgcgcctgcgctgcagcagcctggcgctgctggagctggtggcgtacgcgggcgagggcacctactacttcctggaccagttcctgtggctgatgaaggcgggcttcctgcccaagcaccaggagaaggcagtggccaaggccagcgcatgggccgaggtgctgggctacatgggcagcatcgcgctgtcatgccacaagctgcagcagctcaacatacaggaggcggcgctggcacgcaaactagaagcactcatgaaggacgagcaggacaagcagtgcatcgacggcggcctgctgcggcagctgcagctgctccgctcggcgcgcctgctgcgtctggcgctgatctgccaggacctggccgacagcatgacagccatcaacgacatcacagagggccgtgtgcggggcttcaaccacccagtggcgctcagctgtgcaggcctgctgtcggcagcagtcagcacgtacaagtactggaaagcataggcagctgccaggcagcacagccggcgcaagtgagagttggggagcccgggcaccagccatgcacaacaaatacatgtggcagccctcatggcgtcagcagcagccatggtcacggacgccagcagcagaggctgccaccggccgtggcgcccagctgcagcgctggcgccttgccaaggccccagcttggggcggccagcggactactctgcggctctgctctgcagctgttttctgcagcagctgtgtgtcgttgagtcagggctttattgttcttctcgttttcatttctccttctgtcaatgaagaaactggtggtgtctgcttcatatgtatacattattctcttttgaggtggtgcagcccttgtgccagtttgtggagcgttgtactatgttgtgtgcgccccgtgctacagagttctatgagcatgggccttcaaggctctgcgtaaatgcttctgctgacagctttgcaactcaaaaggctgcgcagcgcacacacattttggtgacatgctgtcaccactgtgacgctgaccttccccgccgttggtactgtgtctggtctgccagggagcacggcagttgccaacacccagtgggtggcccctgcttgacccgcagcgctgccctctgcaaggctgacatggtcgtatgaagtgtacaggtggcaaggtggttgttgttacagcagcaagctcagctaatggctgctgcagcatggttggttgcttatgctgctgttggtacacgtgcagtttcagtgctactagcatgccgcaggaactttgccgcagcctttgagtccagagcctgagcagcaaggcagcaagcatcgctgctgttgtactgtcagcagctcgttgctgccgtgactggctgtgctggctttgaagcagcaggaaggagagcctcctggcagccaactgctatgcttgccagttaggcctagggtgctgcagcttgtgctatagctgctgggctgacatcggcactgcggcacggagctcagctggagctcattcttgctgctgcttgccaagcagtgcagtgtacttgtctgtaacattagaccaggctttggctggtgctacacagaactccgatctgacttgcacctcaccctgcagtgcagggcctacactgcgtggcagccatgcatgctgtcatgctgggctgggtcaccagcat。
20、一种斜生栅藻pex11-2的过表达藻株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
21、步骤1、斜生栅藻的培养：
22、斜生栅藻在含有培养基的锥形瓶中培养，培养过程中每天用手摇动培养基三次并更换其在培养箱中的位置；
23、步骤2、基因克隆与过表达载体的构建；
24、1)斜生栅藻总rna的提取，通过trizol法提取斜生栅藻的总rna；
25、2)斜生栅藻总cdna的获得：
26、提取的总rna通过μni all-in-one first-strand cdna synthesis supermix(transgen biotech)试剂盒进行逆转录反应获得总cdna；
27、3)pex11目的基因的克隆：
28、在斜生栅藻无参转录组测序结果中找到了1个pex11的序列，通过该序列设计引物，并在引物上加上过表达载体上15bp长的重叠接头序列，以斜生栅藻总cdna为模板，扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳实验判断条带大小是否正确，之后进行测序，测序结果与目的基因序列进行比对以确定目的基因扩增成功；
29、4)phy21载体的酶切：
30、使用限制性内切酶将phy21载体线性化，全程冰上进行反应体系的配置，将反应体系混匀后37℃过夜，酶切成功后琼脂糖凝胶电泳观察到有两条带则说明酶切成功，将切好的条带利用胶回收试剂盒进行线性化载体的纯化回收；
31、5)过表达载体的构建以及扩增：
32、纯化后pex11基因片段与phy21过表达载体利用clonexpress iione stepcloning kit试剂盒进行连接,冰上配制连接反应体系，将线性化载体与插入片段加入到microtube中，随后加入5×ce ii buffer以及exnase ii，最后加入ddh2o补足，反应体系用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心后反应，反应完成后立即置于冰上冷却；
33、重组产物通过dh5α感受态细胞进行质粒的扩增,取重组产物与dh5α大肠杆菌吹吸混匀后冰上放置，水浴锅水浴后立刻放于冰上，加入lb液体培养基，摇床培养，培养完成后全部加入到含有氨苄青霉素的lb平板中，均匀涂布后培养箱中培养直到菌落长出；挑取单菌落加入lb液体培养基进行扩培，使用tiangen公司的高纯度质粒小提试剂盒进行质粒的提取，提取的质粒通过nanodrop进行纯度和浓度的检测，进行测序，将pex11已知的序列与测得的序列通过ncbi进行在线序列相似性比对，检测目的基因是否成功连接到质粒上以及连上的目的基因是否存在错配或缺失，保留测序以及验证成功的阳性克隆质粒；
34、步骤3、转化藻株的构建，采用电穿孔法将重组质粒phy21-pex11-2导入到斜生栅藻中。
35、所述的采用电穿孔法将重组质粒phy21-pex11-2导入到斜生栅藻中，具体操作步骤如下：
36、(6)指数生长期的斜生栅藻离心，去上清；
37、(7)预冷的山梨醇洗涤三次后加入山梨醇重悬，加入线性化重组质粒以及鲑鱼精子dna，混匀后冰上孵育；
38、(8)混匀后的体系加入到预冷的电击杯中，进行电击；
39、(9)转化过后的藻细胞转移到三角瓶中，加入培养基，锡纸包裹后黑暗中过夜培养；
40、(10)过夜培养的藻细胞离心收集后涂布在含有博来霉素的固体bg-11板上，培养2-3周后挑取单藻落到含有博来霉素的液体bg-11中进行扩大培养。
41、所述的斜生栅藻总rna的提取包括以下步骤：
42、(6)藻液离心后，取样品于预冷好的研钵中研磨，研磨成粉末后加入trizol，室温静置后，离心；
43、(7)将离心后的上清转移到ep管中，加入氯仿混匀，静置后离心；
44、(8)取上清后加入预冷好的异丙醇，震荡混匀后静置，离心后可在管底出现白色胶状沉淀；
45、(9)弃上清，加入乙醇(冰冷)，用枪将沉淀吹起来，清洗沉淀，离心后倒掉乙醇，重复上述操作，开盖晾干乙醇；
46、(10)加入适量的rnase-free水溶解沉淀，完全溶解后，通过超微量分光光度计nanodrop和琼脂糖凝胶电泳检验所提rna的浓度与质量。
47、一种斜生栅藻phy21-pex11-2的过表达藻株应用于抑制斜生栅藻细胞的分裂，促进斜生栅藻脂质的积累。
48、一种斜生栅藻phy21-pex11-2的过表达藻株应用于盐胁迫下斜生栅藻脂质积累的提高。
49、本发明的有益效果是：
50、本研究选取了斜生栅藻pex11家族中的pex11-2，构建过表达藻株探究pex11在斜生栅藻脂质积累及盐胁迫响应中的潜在作用。结果表明，pex11-2定位在过氧化物酶体膜上且两者的过表达在斜生栅藻脂质积累中发挥着积极作用，可通过调节活性氧(ros)水平、脂质合成相关基因的表达以及碳前体的重新分配促进微藻脂质的积累。此外，pex11-2过表达则可以促进胁迫响应及细胞分裂基因的表达增强微藻的盐胁迫耐受性。总之这些发现证明了pex11基因在微藻脂质代谢以及盐胁迫响应中具有重要作用，可为藻类脂质生产应用研究和工程发展提供新思路。
1.一种斜生栅藻pex11-2，其特征在于，斜生栅藻无参转录组测序结果中通过保守序列调取获得pex11的序列命名为pex11-2，pex11-2共有239个氨基酸，其蛋白序列为：
2.根据权利要求1所述的一种斜生栅藻pex11-2，其特征在于，其cds序列为：
3.根据权利要求1所述的一种斜生栅藻pex11-2，其特征在于，其mrna序列为：
4.一种斜生栅藻pex11-2的过表达藻株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求1所述的一种斜生栅藻pex11-2的过表达藻株的构建方法，其特征在于，所述的采用电穿孔法将重组质粒phy21-pex11-2导入到斜生栅藻中，具体操作步骤如下：
6.根据权利要求1所述的一种斜生栅藻pex11-2的过表达藻株的构建方法，其特征在于，所述的斜生栅藻总rna的提取包括以下步骤：
7.根据权利要求4所述的一种斜生栅藻pex11-2的过表达藻株，其特征在于，一种斜生栅藻phy21-pex11-2的过表达藻株应用于抑制斜生栅藻细胞的分裂，促进斜生栅藻脂质的积累。
8.根据权利要求4所述的一种斜生栅藻pex11-2的过表达藻株，其特征在于，一种斜生栅藻phy21-pex11-2的过表达藻株应用于盐胁迫下斜生栅藻脂质积累的提高。
