本发明属于虫害防治生物。
背景技术：
1、苏云金芽孢杆菌(bt，bacillus thuringiensis)是一种细菌，广泛应用于虫害防治。其抗虫功能在于其在多个生理过程中会伴随着分泌大量有毒蛋白，这些蛋白对人伤害较小，却可以有效抑制虫类生长，甚至直接杀死昆虫，因此在农业领域有很高的贡献。bt体内有很多种毒素，主要分为cry蛋白和cyt蛋白，由cry基因和cyt基因编码。cry蛋白分为5类，cryi对鳞翅目有杀虫活性，cryii类对鳞翅目和双翅目有杀虫活性，cryiii对鞘翅目有杀虫活性，cryiv类对双翅目有杀虫活性，cry v类对鳞翅目和鞘翅目有杀虫活性。
2、玉米螟是一类鳞翅目昆虫，是对中国农业生产影响最大的害虫之一，也是玉米生产上最重要的害虫，玉米螟造成的损失范围广，面积大。通过对玉米螟的杀灭可挽回大量农产品损失。然而玉米螟的防治是困难的，因为玉米株高限制，通过化学防治需要更重型的仪器。所以，从玉米品种着手培养抗虫株系是解决玉米虫害的思路之一，然而玉米天然基因中罕有抗虫位点，因此转入外源基因的方法已经被提出和验证。
技术实现思路
1、本发明的目的是针对玉米螟钙黏蛋白的bt毒蛋白(cry3aa)，能够更高效的抑制并杀灭玉米螟，应用于转基因作物和农药制剂中的基于蛋白定向进化的bt毒蛋白。
2、本发明毒蛋白的构建过程是：
3、(1)构建载体：sp-cry3aa/s2208，ap-pncad/s2060；
4、(2)将mp质粒转化到ap-pncad/s2060，构建为mp/ap-pncad/s2060；
5、(3)用sp-cry3aa/s2208制备初始噬菌体，培养6h以上，离心上清即giii缺陷型m13噬菌体，用于pace系统开展；
6、(4)用mp/ap-pncad/s2060制备初始宿主菌；
7、(5)系统装配：
8、①将40ml宿主菌转移至chemostat瓶中，启动蠕动泵1，吸取培养基至chemostat瓶中，调整废液针至80ml处，保持chemostat瓶中液面维持在80ml处；
9、②lagoon瓶内加15ml宿主菌，并加入终浓度～107pfu/ml的噬菌体，调整废液针至15ml处；
10、③准备注射泵，注射器装满250mm阿拉伯糖，排尽管内空气，将注射器安装在注射泵上，将注射泵连接到lagoon瓶；
11、④将所有废液连接到废液桶中，连接蠕动泵，打开各蠕动泵和注射泵；
12、⑤每日取样，计算噬菌体滴度，当噬菌体浓度低于1*104时，适量补充噬菌体以稳定系统运行，样品留存，测序；
13、⑥当系统运行至144h起，发现噬菌体滴度逐渐增长，说明cry3aa已经产生了有益的突变；⑦经测序验证，发现突变积累。
14、本发明毒蛋白在seq id no.1所示的氨基酸序列中，具有下述的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代：第20位、第136位、第215位、第374位，且与seq id no.1所示的氨基酸序列具有96％以上同一性并具有bt毒蛋白毒性。
15、本发明bt毒蛋白cry3aa杀虫剂在病虫害防治领域中的应用。
16、本发明专门针对玉米螟bt毒蛋白(cry3aa)受体钙粘蛋白进行进化，获得与钙粘蛋白互作更强的蛋白，解决了玉米螟的进化导致耐受野生型bt毒蛋白(cry3aa)的问题，理论上要比野生型的bt毒蛋白(cry3aa)更具有毒性。本发明筛选方法是在噬菌体展示额度基础上利用噬菌体的突变机制和蛋白互作机制进行高通量筛选，操作简单。筛选出的突变体与野生型cry3aa相似度为99.7％，通过噬斑法和split-luc法验证，与钙粘蛋白有更强的互作能力，如果应用于玉米转基因，将极大地提高抗虫效率。
1.一种基于蛋白定向进化的bt毒蛋白，其特征在于：毒蛋白的构建过程是：
2.根据权利要求1所述的基于蛋白定向进化的bt毒蛋白，其特征在于：毒蛋白在seq idno.1所示的氨基酸序列中，具有下述的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代：第20位、第136位、第215位、第374位，且与seq id no.1所示的氨基酸序列具有96％以上同一性并具有bt毒蛋白毒性。
3.根据权利要求1所述的基于蛋白定向进化的bt毒蛋白，其特征在于：bt毒蛋白cry3aa杀虫剂在病虫害防治领域中的应用。
