本发明属于生物，具体设计一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的制备方法和应用。
背景技术：
0、技术背景
1、新型冠状病毒由一条正义rna链和4种结构蛋白(s：刺突蛋白；n：核衣壳蛋白；m：膜蛋白；e：包膜蛋白)组成。目前新冠的主要检测方法为核酸检测法和免疫分析法。实时荧光pcr法为代表的核酸检测法，由于其高灵敏度做为新冠检测的金标准，但其操作步骤繁琐、样本制备程序复杂、需专业的操作人员及设备，极大限制新冠的筛选效率，仍需一种操作简单、快速、灵敏的新冠检测手段。基于双单克隆抗体夹心的免疫层析试纸条具有操作简单、检测速度快、原位检测等优点，如专利“一种基于荧光免疫层析法的新冠病毒抗原检测试剂盒”(申请号：cn202210582441.1)，基于双单克隆抗体夹心的方法提供一种原位快速检测新冠抗原的荧光层析试纸条，新冠诊疗方案(试行第十版)也已将免疫层析试纸条法做为新的诊断标准。在新冠的免疫层析法，单克隆抗体是最常用的免疫分析元件，如专利“抗sars-cov-2核衣壳蛋白的单克隆抗体及其应用”(申请号：cn202210623337.2)，描述了一种抗新冠核衣壳蛋白单抗及其在免疫分析中的应用，然而单克隆抗体制备周期长、稳定性差、成本较高、批间差异大，开发一种单抗的替代元件是十分必要的。
2、单链抗体(single chain antibody fragment，scfv))是由10-20个氨基酸的短肽链连接重链可变区和轻链可变区组成的一种抗体片段。相比传统单抗，具有制备简单、成本低廉、易于改造等优点。因此，开发高灵敏、强特异的抗新冠病毒单链抗体将在免疫分析领域具有广阔的应用前景。
技术实现思路
1、为解决传统单克隆抗体存在的不足，本发明旨在开发高灵敏、强特异的单链抗体，以期做为传统抗体的替代品，应用于各种新冠的免疫分析平台。
2、首先，本发明第一个目的是提供一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体，所述单链抗体具有seq id no：1-seq id no：3的氨基酸序列。
3、其中，所述单链抗体由重链可变区、连接肽、轻链可变区组成，与新型冠状病毒核衣壳蛋白有着优异的结合性能及特异性；所述连接肽的氨基酸序列为：(ggggs)×3。
4、本发明第二个目的是提供一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的制备方法，具体包括以下步骤：
5、(1)将新冠n蛋白(核衣壳蛋白)表达质粒转化大肠杆菌bl21(de3)，将转化的单菌落接种至250ml锥形瓶中培养至对数生长期，异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导表达，将表达产物进行超声破碎后，ni-nat柱进行纯化，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)、elisa鉴定表达重组n蛋白。
6、(2)将表达新冠n蛋白作为免疫源，选择3只小鼠做为免疫小鼠，初次免疫使用弗氏完全佐剂与新型冠状病毒n蛋白等比例混合后注射，免疫2周后进行第二次免疫，采用弗氏不完全佐剂与抗原等比例混合后注射。每隔1周如上进行第3-5次免疫。免疫方法为皮下多点注射，在背部、腹部和腋窝处。最后一次免疫后，elisa测定每只小鼠血清效价。
7、(3)解剖小鼠，提取小鼠脾细胞rna，反转录成cdna，合成重链可变区和轻链可变区扩增引物，pcr扩增重链可变区和轻链可变区，重叠延伸pcr将抗体重链可变区通过连接肽(ggggsggggsggggs)与轻链可变区进行拼接成scfv片段；快切酶酶切scfv和噬菌粒pcantab5e，t4连接酶重新连接，将重组噬菌粒转入大肠杆菌tg1中，构建单链抗体噬菌体文库；取部分噬菌体文库，加入辅助噬菌体m13k07，构建重组噬菌体，测定滴度。
8、(4)将表达的新冠n蛋白做为包被蛋白至酶标孔，投入重组噬菌体孵育一段时间，pbst洗去不结合或结合力弱的重组噬菌体，酸洗脱靶标噬菌体，再将洗脱的噬菌体扩增至一定滴度作为下一轮筛选的单链抗体。按照“吸附-洗涤-洗脱-扩增”步骤进行了3-5轮筛选，在筛选的过程中，改变pbst的浓度、噬菌体孵育时间等条件，使得筛选条件变得逐渐苛刻，以便筛选到亲和力及特异性更强的单链抗体噬菌体。
9、(5)经过几轮筛选之后，选取20个噬菌体进行phage-elisa的鉴定，使用新冠受体结合区蛋白、牛血清白蛋白、卵清白蛋白做为作为阴性对照，pbs作为空白对照；获取了7条效果较佳与新冠n蛋白特异性结合的重组噬菌体展示单链抗体，将这7个单链抗体噬菌体进行扩增、质粒提取、测序，获取3种单链抗体，所述单链抗体由重链可变区、连接肽、轻链可变区组成，插入在噬菌体的外壳蛋白基因上。
10、进一步的，所述核衣壳蛋白由原核表达系统产出；抗核衣壳蛋白的噬菌体单链抗体通过ph洗脱法筛选得到，洗脱法的ph值为2-10；所述鉴定噬菌体特异性使用蛋白为新冠受体结合区蛋白、牛血清白蛋白、卵清白蛋白。
11、进一步的，所述的单链抗体噬菌体文库的构建方法，主要包含如下步骤：
12、(1)从鼠脾细胞扩增抗体重链和轻链并拼接成单链抗体，在抗体两端引入sfi i和not i酶切位点；(2)与噬菌粒pcantab 5e酶切重组，t4连接酶进行连接构建噬菌体展示文库。
13、其中，抗体两端引入sfi i和not i酶切位点所用试剂和用量为：2-6μl 10×quickcutbuffer，1-3μl sfi i酶，1-3μl not i酶，20-140μl rnase free h2o，10-50μgscfv抗体基因，10-50μg噬菌粒pcantab 5e。
14、进一步的，所述抗体基因扩增体系为：1-100nm vh-上，1-100nm vh-下，1-100nmvl-上，1-100nm vl-下，0.1-10μg重链可变区，0.1-10μg轻链可变区，20-140μl rnase freeh2o，10-100μl primestar扩增酶，1-5μlprimestarbuffer；反应条件为：98℃180s，50℃15s，72℃15s，重复25cycle，72℃3min。
15、进一步的，所述ph洗脱法筛选，主要包含如下步骤：
16、(1)包被5-50μg新冠核衣壳蛋白至400μl酶标孔，37℃孵育1-2h；
17、(2)0.1-0.5％pbst洗板5-10次，3-5％牛血清包蛋白bsa或卵清白蛋白ova 37℃封闭1-2h；
18、(3)0.1-0.5％pbst洗板5-10次，投入1-9×109重组噬菌体，37℃孵育30-60min；
19、(4)0.1-0.5％pbst洗板5-10次，100-200μl 0.1mph＝2.2的gly-hcl孵育15min，加入10-20μl 1m ph＝9.1的tris-hcl，测定滴度，并挑取单克隆噬菌体进行phage-elisa鉴定。
20、其中，所述步骤(3)中重组噬菌体由噬菌粒pcantab 5e和辅助噬菌体m13k07重组构建。
21、第三方面，本发明提供一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的应用，本发明的噬菌体展示单链抗体可特异性与新冠n蛋白结合，可作为传统新冠n蛋白单克隆抗体的替代元件，应用于新冠的免疫分析领域。
22、本发明具有以下益处：
23、(1)与传统的单抗相比，本发明的噬菌体展示单链抗体具有制备流程简单、成本低廉、生物安全性高、易于改造和修饰等优点。
24、(2)本发明的3条单链抗体序列是国内外首次报道，具有较高的创新性。
25、(3)本发明提供的噬菌体展示单链抗体可做为核心检测元件，应用于多种检测新冠病毒的免疫分析平台。
1.一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体，其特征在于，所述单链抗体具有seqid no：1-seq id no：3的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体，其特征在于，所述单链抗体由重链可变区、连接肽、轻链可变区组成，与新型冠状病毒核衣壳蛋白有着优异的结合性能及特异性；
3.根据权利要求1或2所述的一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的制备方法，其特征在于，主要包含如下步骤：
4.根据权利要求3所述的一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的制备方法，其特征在于，所述核衣壳蛋白由原核表达系统产出；所述洗脱法的ph值为2-10；所述鉴定噬菌体特异性使用蛋白为新冠受体结合区蛋白、牛血清白蛋白、卵清白蛋白。
5.根据权利要求3所述的一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的制备方法，其特征在于，所述的单链抗体噬菌体文库的构建方法，主要包含如下步骤：
6.根据权利要求5所述的一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的制备方法，其特征在于，所述两端引入sfi i和not i酶切位点所用试剂和用量为：2-6μl 10×quickcutbuffer，1-3μl sfi i酶，1-3μl not i酶，20-140μl rnase free h2o，10-50μgscfv抗体基因，10-50μg噬菌粒pcantab 5e。
7.根据权利要求5所述的一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的制备方法，其特征在于，所述抗体基因扩增体系为：1-100nm vh-上，1-100nm vh-下，1-100nm vl-上，1-100nm vl-下，0.1-10μg重链可变区，0.1-10μg轻链可变区，20-140μl rnase free h2o，10-100μl primestar扩增酶，1-5μlprimestarbuffer；反应条件为：98℃180s，50℃15s，72℃15s，重复25cycle，72℃3min。
8.根据权利要求3所述的一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的制备方法，其特征在于，所述ph洗脱法筛选，主要包含如下步骤：
9.根据权利要求8所述的一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的制备方法，其特征在于，所述重组噬菌体由噬菌粒pcantab 5e和辅助噬菌体m13k07重组构建。
10.根据权利要求1或2所述的一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的应用，其特征在于，所述单链抗体应用于新型冠状病毒的多种免疫分析平台。
