本发明属于生物材料、组织工程和再生医学领域，应用于脊髓损伤修复和脊髓类器官制造，具体涉及一种生物活性水凝胶的制备和应用。
背景技术：
1、脊髓损伤(spinal cord injury,sci)是一种严重的中枢神经系统疾病，造成患者永久性或暂时性的感觉和运动功能丧失。成年哺乳类动物脊髓损伤后自主再生能力十分有限，这归因于脊髓损伤后病理进程中产生的抑制性因素。这些抑制性因素包括硫酸软膏蛋白多糖、髓鞘蛋白和缺乏营养因子。然而，新生儿脊髓损伤后有强大的自主再生能力，并且作为细胞外基质(extracellular matrix,ecm)的纤连蛋白在损伤后桥接了损伤两端。这提示本发明提供的细胞外基质在脊髓损伤修复中发挥重要作用，并且新生期脊髓的细胞外基质具有有效的促再生能力。那么，分离得到新生期脊髓细胞外基质作为生物活性材料用于治疗脊髓损伤是一种充满前景的修复策略。
2、脱细胞细胞外基质水凝胶(decellularized extracellular matrix hydrogel,decmgel)是通过去除细胞胞内成分从而保留组织特异性的细胞外基质成分，然后在酸性溶液中酶解，最后中和ph值和平衡离子强度后在37℃下形成水凝胶。decmgel作为一种从天然组织/器官来源的生物活性材料，其在组织工程和再生医学领域中有着广泛的应用。目前报道的脱细胞脊髓细胞外基质水凝胶(decellularized spinal cord extracellularmatrixhydrogel,dscmgel)主要是从成年期动物脊髓制备得来。已有的研究报道中显示成年期脱细胞脊髓细胞外基质水凝胶(decellularized adult spinal cord extracellularmatrixhydrogel,dascmgel)相比于ⅰ型胶原水凝胶和坐骨神经来源的脱细胞水凝胶更有利于神经前体细胞的增殖、迁移和分化，同时也更好地促进了脊髓损伤的修复。这些研究证明了脊髓组织特异性来源的decmgel在脊髓损伤修复中的优势。但是由于组织/器官的细胞外基质成分随着发育进程而改变，因此不同发育时期脊髓组织的细胞外基质成分是有差异。
技术实现思路
1、本发明提供一种生物活性水凝胶的制备和应用。本发明以脱细胞处理后的脊髓细胞外基质作为原料，制备生物活性水凝胶。
2、第一方面，本发明提供一种脊髓组织脱细胞方法，包括：使用双蒸水、triton x-100或脱氧胆酸盐浸泡处理脊髓组织的过程中，温度为4-6℃，转速为150-180rpm，每次处理时间不超过6小时。
3、本发明所提供的脊髓组织脱细胞方法，包括：
4、(1)将新鲜脊髓组织双蒸水浸泡，在4-6℃，以150-180rpm搅拌4-6小时除血渍，冻存于-80℃冰箱；
5、(2)从-80℃冰箱取出脊髓在室温下解冻，然后在4-6℃摇床中用双蒸水以150-180rpm搅拌4小时；
6、(3)然后用300-800w进行超声，时间为40-100min，温度10-20℃；
7、(4)再用triton x-100浸泡，在4-6℃，以150-180rpm搅拌4-6小时，然后换用双蒸水清洗；
8、(5)再用脱氧胆酸盐浸泡，在4-6℃，以150-180rpm搅拌2-4小时，然后换用双蒸水清洗；
9、(6)再用dnaseⅰ和rnase，在37℃摇床中，以120-150rpm处理2-3小时；
10、(7)再用双蒸水在4-6℃摇床中以150-180rpm清洗10-12小时，获得脱细胞的脊髓细胞外基质；
11、(8)冻存于-80℃冰箱过夜，然后用超临界二氧化碳对脱细胞的脊髓细胞外基质进行干燥，压力为20-60mpa，温度为25-45℃，二氧化碳流量为0.2-8l/min，时间60-120min。
12、本发明所提供的脊髓组织脱细胞方法中，所用triton x-100的体积浓度为2.5-3％；所用脱氧胆酸盐的体积浓度为1.5-2％；所用dnaseⅰ的浓度为40-50u/ml；所用rnase的浓度为8-10μg/ml。
13、本发明所提供的脊髓组织脱细胞方法中，所述脊髓组织为新生期脊髓组织。
14、本发明利用蛋白质组学检测了胚胎期、新生期和成年期脊髓组织的细胞外基质成分变化。结果显示胚胎期、新生期脊髓相较于成年期含有更多种类的细胞外基质蛋白(图1的a-b)。其次，相比于成年期脊髓，新生期和胚胎期脊髓的细胞外基质成分和生物学功能更加接近(图1的c-d)。并且胚胎期和新生期脊髓细胞外基质比成年期脊髓上调和细胞外基质结构、神经系统发育、轴突发育和神经发生等相关生物学功能(图1的e-f)。
15、相反，成年期脊髓包含更多抑制脊髓损伤再生的成分，如硫酸软骨素蛋白多糖和髓鞘蛋白，这会限制成年期脱细胞脊髓细胞外基质水凝胶的应用价值(图1的g)。得到包含更多脊髓发育信号的脱细胞细胞外基质水凝胶材料对于脊髓损伤修是更有利的。
16、因此，胚胎期和新生期脊髓是比成年期脊髓更适合作为脱细胞脊髓细胞外基质水凝胶的原材料来源。考虑到胚胎期脊髓组织难以获得，以及胚胎期和新生期脊髓在细胞外基质成分和功能上的高度相似，本发明选择新生期脊髓组织作为材料来源。
17、作为本发明的一个具体实施方式，新生期脊髓脱细胞方法，包括：
18、(1)脊髓组织浸泡在双蒸水中用4-6℃摇床以150-180rpm搅拌4-6小时去除血渍，然后沥干水分冻存于-80℃冰箱；
19、(2)从-80℃冰箱取出脊髓在室温下解冻，然后在4-6℃摇床中用双蒸水以150-180rpm搅拌4小时；
20、(3)然后用300-800w进行超声，时间为40-100min，温度10-20℃；
21、(4)用3％(v/v)triton x-100(cat#v900502,vetec)溶液在4-6℃摇床中以150-180rpm搅拌4-6小时，然后换用双蒸水清洗1小时；
22、(5)接着用2％(v/v)脱氧胆酸盐(钠)(cat#30970,sigma.aldrich)溶液在4-6℃摇床中以150-180rpm搅拌2-4小时，然后换用双蒸水清洗1小时；
23、(6)再用50u/ml dnaseⅰ(cat#d4513,sigma.aldrich)和10μg/ml rnase(cat#r6513,sigma.aldrich)在37℃摇床中以120-150rpm处理3小时；
24、(7)用双蒸水在4-6℃摇床中以150-180rpm清洗过夜，沥干水分后冻存于-80℃冰箱；
25、(8)冻存于-80℃冰箱过夜，然后用超临界二氧化碳对脱细胞的脊髓细胞外基质进行干燥，压力为20-60mpa，温度为25-45℃，二氧化碳流量为0.2-8l/min，时间60-120min。
26、上述步骤(1)-(8)即可得到脱细胞脊髓细胞外基质，为了方便储存，可以将所得的脊髓细胞外基质进行冻干。
27、第二方面，本发明提供一种脱细胞脊髓细胞外基质，采用上述脊髓组织脱细胞方法制备得到。
28、第三方面，本发明提供一种脱细胞脊髓细胞外基质水凝胶，由上述脱细胞脊髓细胞外基质制备得到。
29、由于目前没有报道过新生期脊髓的脱细胞方案，并且新生期脊髓质地柔软容易在脱细胞处理过程中严重损失。此外，超声处理能帮助在去除细胞内成分的同时有效的保留细胞外基质成分，同时为了保持蛋白活性采用了超临界二氧化碳干燥法。因此，本发明开发了适用于新生期脊髓组织的脱细胞处理方法，并成功得到了新生期脱细胞脊髓细胞外基质水凝胶(decellularized neonatal spinal cord extracellular matrix hydrogel,dnscmgel)材料。
30、第四方面，本发明提供上述脱细胞脊髓细胞外基质水凝胶的制备方法，包括：
31、(1)25-30℃下，将上述得到的脱细胞脊髓细胞外基质的冻干粉，在含有胃蛋白酶的盐酸溶液中，以150-180rpm消化16-24小时；
32、(2)消化结束后，0-4℃下，使用20000-25000rpm离心25-30min，去除未消化掉的颗粒，取上清液真空冻干，获得冻干后的材料；
33、(3)将步骤(2)冻干后的材料以6-10mg/ml浓度复溶于盐酸溶液中，并在4℃下放置10-12小时；
34、(4)再用氢氧化钠溶液中和步骤(3)所得溶液的ph值为中性，再加入10x磷酸盐缓冲液混匀，最后用1x磷酸盐缓冲液稀释；
35、(5)将步骤(4)所得的的溶液置于30-37℃培养箱中20-30分钟形成水凝胶。
36、第五方面，本发明所提供的脱细胞脊髓细胞外基质水凝胶制备方法，步骤(4)中，稀释至所述冻干后的材料浓度为2-2.5mg/ml用于形成脱细胞脊髓细胞外基质水凝胶。
37、作为本发明的一个具体实施方式，脱细胞脊髓细胞外基质水凝胶的制备以冻干后的脱细胞脊髓细胞外基质作为原料，先进行消化并纯化后，再制备得到水凝胶，具体步骤如下：
38、(1)取出4℃保存的脱细胞脊髓细胞外基质材料在含有1mg/ml胃蛋白酶(cat#p7000,sigma.aldrich)的0.01m盐酸溶液中用28℃摇床以150-180转(rpm)消化16-24小时；
39、(2)消化结束后用4℃离心机以25000rpm离心30min，去除未消化掉的颗粒，取上清液于-80℃冰箱冻存过夜后真空冻干；
40、(3)使用时称取材料以6mg/ml浓度复溶于0.01m盐酸溶液中在4℃冰箱过夜；
41、(4)复溶后用1/10体积的0.1m氢氧化钠溶液中和ph值为中性，再加入1/10体积的10x磷酸盐缓冲后混匀，最后用1x磷酸盐缓冲液稀释为2.5mg/ml浓度使用；
42、(5)然后置于37℃培养箱中10-20分钟形成水凝胶。
43、根据本领域技术人员的理解，本发明还提供了上述脱细胞脊髓细胞外基质或上述脱细胞脊髓细胞外基质水凝胶在制备脊髓损伤修复药品中的应用。
44、本发明还提供一种脊髓损伤修复药品，含有上述脱细胞脊髓细胞外基质或上述脱细胞脊髓细胞外基质水凝胶。
45、以及，上述脱细胞脊髓细胞外基质或上述脱细胞脊髓细胞外基质水凝胶在全横断脊髓损伤修复、促进脊髓运动神经元类器官形成、促进脊髓类器官的轴突生长中的应用。
46、近年来脱细胞细胞外基质水凝胶已经在类器官研究中得到应用，并且相比于传统商用的matrigel显示出独特的优势。目前，还没有研究报道将脱细胞脊髓细胞外基质水凝胶应用于脊髓类器官的制造。本发明成功将新生期和成年期脱细胞脊髓细胞外基质水凝胶应用于脊髓类器官的制造。并且利用类器官模型鉴定了dnscmgel依赖于多效生长因子(pleiotrophin,ptn)和肌腱蛋白(tenascin,tnc)这两种细胞外基质蛋白促进了脊髓类器官轴突延伸。
47、本发明的有益效果在于：
48、本发明针对较为脆弱的脊髓组织，提供了脱细胞的方法，采用本发明提供的方法，成功获得了新生期和成年期脱细胞脊髓细胞外基质。并且本发明验证了将细胞脊髓细胞外基质制备为水凝胶可以应用于脊髓类器官的制造。并且利用类器官模型鉴定了新生期脱细胞脊髓细胞外基质水凝胶(dnscmgel)依赖于多效生长因子(pleiotrophin,ptn)和肌腱蛋白(tenascin,tnc)这两种细胞外基质蛋白促进了脊髓类器官轴突延伸。
1.一种脊髓组织脱细胞方法，其特征在于，包括：使用双蒸水、triton x-100或脱氧胆酸盐浸泡处理脊髓组织的过程中，温度为4-6℃，转速为150-180rpm，每次处理时间不超过6小时。
2.根据权利要求1所述的脊髓组织脱细胞方法，其特征在于，包括：
3.根据权利要求2所述的脊髓组织脱细胞方法，其特征在于，所用triton x-100的体积浓度为2.5-3％；所用脱氧胆酸盐的体积浓度为1.5-2％；所用dnaseⅰ的浓度为40-50u/ml；所用rnase的浓度为8-10μg/ml。
4.根据权利要求1-3任一项所述的脊髓组织脱细胞方法，其特征在于，所述脊髓组织为新生期脊髓组织。
5.一种脱细胞脊髓细胞外基质，其特征在于，采用权利要求1-4任一项所述脊髓组织脱细胞方法制备得到。
6.一种脱细胞脊髓细胞外基质水凝胶，其特征在于，由权利要求5所述脱细胞脊髓细胞外基质制备得到。
7.权利要求6所述脱细胞脊髓细胞外基质水凝胶的制备方法，其特征在于，包括：
8.一种脊髓损伤修复药品，其特征在于，含有权利要求5所述脱细胞脊髓细胞外基质或权利要求6所述脱细胞脊髓细胞外基质水凝胶。
9.权利要求5所述脱细胞脊髓细胞外基质或权利要求6所述脱细胞脊髓细胞外基质水凝胶在制备脊髓损伤修复药品中的应用。
10.权利要求5所述脱细胞脊髓细胞外基质或权利要求6所述脱细胞脊髓细胞外基质水凝胶在全横断脊髓损伤修复、促进脊髓运动神经元类器官形成、促进脊髓类器官的轴突生长中的应用。
