本发明属于生物医药领域，特别涉及一种细胞膜仿生纳米材料及其制备和应用。
背景技术：
1、缺血再灌注损伤(iri)是一个复杂的病理生理过程，可对脑功能造成严重损害。iri的机制复杂，涉及氧化应激、炎症反应失衡、细胞内钙超载、线粒体功能障碍、能量代谢紊乱、凋亡相关基因异常激活等(front.mol.neurosci.2020,13,28；actaneuropathol.2019,137,693-714；oxid.med.cell.longev.2018,3804979；jama,2015,313,1451-1462)。其中炎症反应异常活化和氧化应激在脑iri的发生发展中起重要作用，可通过级联反应最终导致不可逆的神经元损伤(int.j.mol.sci.2017,18,1599；neurotherapeutics,2016,13,661-670；lancet neurol.2019,18,1058-1066；nature,2014,515,431；nat.rev.immunol.2019,19,473-473)。因此，降低氧化应激、调节促炎微环境、保护神经元和促进血管再生的联合治疗是有效预防和控制缺血性脑卒中的重要策略。
2、为减少药物的毒副作用和提高其生物利用度，高效输送药物到炎症病灶部位是实现缺血性脑卒中精准高效治疗的必要条件。此外，单一的治疗药物很难应对脑卒中复杂的致病机制，因而通常需要两种或多种手段联合，发挥高效协同治疗的效果，例如抗炎、抗氧化、抗凋亡和促再生协同治疗。已有文献报道恶性肿瘤细胞(如乳腺癌，4t1细胞)容易透过bbb形成脑转移，研究者将4t1细胞膜包裹在琥珀酰氯负载的ph敏感聚合物纳米载体内部(mpp/scb)，发现mpp/scb可优先输送至短暂性大脑中动脉闭塞(tmcao)大鼠模型的缺血部位(比正常脑组织高4.79倍)(nano lett.2021,21,3033-3043.)。该治疗产生了显著的行为恢复、梗死体积减少和明显的神经保护作用。然而，使用4t1癌细胞膜穿透bbb这一设计是否会产生自身免疫原性仍需进一步验证。
3、检索国内外相关文献和专利结果表明：尚未发现以亚磷酸钠盐修饰的含磷树状大分子作为载体同时负载fn和edv并包覆细胞膜用于缺血再灌注引发脑部损伤的抗氧化、抗炎、抗凋亡和促再生的协同治疗的相关报道。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是提供一种细胞膜仿生纳米材料及其制备和应用。本发明利用亚磷酸酯钠盐封端的含磷树状大分子为载体，通过静电力、氢键、阳离子-π、疏水作用等物理间相互作用力与fn结合自组装形成纳米复合物，进一步通过物理负载依达拉奉；提取巨噬细胞膜，对该纳米复合物进行包覆，构建细胞膜仿生纳米药物。制备的细胞膜仿生纳米药物可穿透bbb快速靶向病灶部位，提高药物的递送效率，一方面可改善依达拉奉水溶性差、半衰期短、不易透过bbb、生物利用度低等缺点，从而高效发挥依达拉奉的抗氧化能力；另一方面，纳米药物可有效发挥含磷树状大分子和fn自身的抗炎活性，通过缓解氧化应激、小胶质细胞m2极化转型和降低促炎细胞因子水平从而减轻炎症反应并抑制细胞凋亡。设计的细胞膜仿生的纳米平台可实现对缺血再灌注引发的脑部损伤疾病的抗氧化、抗炎、抗凋亡和促再生的协同联合治疗。
2、本发明提供一种含磷树状大分子纳米复合材料，其特征在于，所述复合材料以亚磷酸钠盐修饰的含磷树状大分子为载体，表面修饰纤连蛋白fn，并负载药物edv。
3、优选地，所述药物为依达拉奉。
4、本发明提供一种细胞膜仿生纳米材料，所述细胞膜仿生纳米材料为巨噬细胞膜包覆所述含磷树状大分子纳米复合材料。
5、进一步地，将亚磷酸钠盐修饰的含磷树状大分子先通过静电力、氢键、阳离子-π、疏水作用等物理间相互作用力与纤连蛋白(fn)结合，再通过物理负载依达拉奉形成纳米复合物；提取巨噬细胞膜，对该纳米复合物进行包覆，构建细胞膜仿生纳米药物。
6、优选地，所述细胞膜为raw细胞膜，进一步地为raw264.7细胞膜。
7、进一步地，所述raw细胞膜的制备，包括：将苯甲基磺酰氯pmsf与低渗细胞裂解液混合均匀，然后将该细胞裂解混合液加入到raw264.7沉淀中，冰浴，反复冻融破碎细胞，梯度离心，沉淀为raw细胞膜，重悬于1×pbs溶液得raw细胞膜悬液。
8、所述pmsf与低渗细胞裂解液的体积比为1:100-150；raw细胞沉淀与细胞裂解混合液的比例为1-2×107个：1-2ml；冰浴时间为15-30min；反复冻融破碎的参数为：液氮冷冻，37-40℃水浴融化，反复3-5次；梯度离心的参数为：离心温度为4-10℃，先以700-1000g离心力离心10-15min，去沉淀，再以12000-14000g离心力离心30-35min，去上清，将沉淀重悬于100-120μl的1×pbs溶液。
9、进一步地，载药纳米平台是通过静电力、氢键、阳离子-π、疏水相互作用等作用力将亚磷酸钠盐修饰的含磷树状大分子与fn结合，然后通过物理负载药物edv，形成纳米复合物，并进一步通过物理挤压的方式在纳米复合物表面包覆raw264.7巨噬细胞膜，构建细胞膜仿生纳米药物a-f/e@m用于缺血性脑卒中的抗炎/抗氧化/促再生的联合治疗。
10、本发明提供一种细胞膜仿生纳米材料的制备方法，包括：
11、(1)将亚磷酸钠盐修饰的含磷树状大分子ak137溶液、纤连蛋白fn溶液混合，室温剧烈搅拌反应，搅拌至溶液呈乳白色，离心，得到ak137-fn复合物(a-f nps)；其中ak137结构式：
12、(2)将药物、ak137-fn复合物溶液混合，室温搅拌，离心取上清，得到含磷树状大分子复合材料；
13、(3)含磷树状大分子纳米复合材料、细胞膜悬液混合，挤出器挤出、离心，得到细胞膜仿生纳米材料。
14、上述制备方法的优选方式如下：
15、所述步骤(1)中ak137与fn的质量比为12:1-2；所述fn溶液、ak137溶液的溶剂均为水。
16、所述步骤(1)中ak137溶液的浓度为30-35mg/ml；fn溶液的浓度为1.5-3.5mg/ml。
17、所述步骤(1)中混合为fn溶液逐滴加入ak137溶液中；室温搅拌反应时间为4-8h；所述离心为离心温度为4-10℃，以12000-14000g离心力离心10-15min，收集沉淀；离心后纯化，纯化的工艺条件为：冷冻干燥。
18、所述步骤(2)中ak137-fn复合物、药物的质量比为2-3：1；所述药物为依达拉奉edv。
19、所述步骤(2)中混合为药物逐滴滴加到a-f nps复合物溶液中，其中药物浓度为1-2mg/ml；所述药物的助溶剂为甲醇；所述室温搅拌反应时间为20-24h；所述离心温度为4-10℃，以1000-1500g离心力离心10-15min，去除沉淀；所述离心后纯化，纯化的工艺条件为：冷冻干燥。
20、所述步骤(2)中药物为edv，则含磷树状大分子复合材料为共负载edv和fn的纳米复合物(a-f/e nps)；
21、所述步骤(3)中含磷树状大分子纳米复合材料、细胞膜的质量比为1:1-2；所述细胞膜为raw细胞膜；所述挤出：使用滤膜孔径为400-600nm的avanti微型挤出器反复挤压11-15次。
22、所述步骤(3)中细胞膜仿生纳米材料为a-f/e@m。
23、本发明提供一种所述细胞膜仿生纳米材料在制备抗氧化、抗炎、抗凋亡和促再生的联合协同治疗药物中的应用。
24、本发明还提供了一种细胞膜仿生的纳米材料在缺血性脑卒中的抗炎/抗氧化/促再生的联合治疗应用方法。
25、本发明提供一种所述细胞膜仿生纳米材料在制备预防或治疗脑梗死、脑卒、脑细胞损伤药物中的应用。
26、本发明提供一种细胞膜仿生的含磷树状大分子负载fn/edv纳米药物的制备和应用。以亚磷酸钠盐修饰的含磷树状大分子与fn结合并物理负载edv，并包裹巨噬细胞膜，构建细胞膜仿生的复合纳米药物。该纳米药物可穿透血脑屏障(bbb)快速靶向病灶部位，提高药物的递送效率，一方面可改善依达拉奉水溶性差、半衰期短、不易透过bbb、生物利用度低等缺点，从而高效发挥依达拉奉edv的抗氧化能力；另一方面，纳米药物可有效发挥含磷树状大分子和纤连蛋白fn自身的抗炎活性，通过缓解氧化应激、小胶质细胞m2极化转型和降低促炎细胞因子水平减轻炎症反应并抑制细胞凋亡，同时缺血再灌注后纤连蛋白可以促进缺血区域内的血管内皮细胞生长，有助于恢复病灶部位的血流量，从而实现脑卒中抗氧化、抗炎、抗凋亡和促再生的协同治疗。因此，设计的细胞膜仿生的纳米平台可实现对缺血再灌注引发的脑部损伤疾病的抗氧化、抗炎、抗凋亡和促再生的联合治疗。
27、本发明首先通过静电力、氢键、阳离子-π、疏水相互作用等作用力将亚磷酸钠盐修饰的含磷树状大分子与fn结合，然后通过物理吸附将edv负载在纳米复合物疏水空腔，并进一步通过物理挤压的方式在纳米复合物表面包覆raw264.7巨噬细胞膜，构建细胞膜仿生纳米药物得到a-f/e@m用于缺血性脑卒中的抗炎/抗氧化/促再生的联合治疗。
28、本发明使用zeta电势及动态光散射分析(dls)、紫外可见吸收光谱(uv-vis)、透射电子显微镜(tem)、扫描电子显微镜(sem)、sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)等手段表征制备的细胞膜仿生的a-f/e@m纳米药物的物理化学性质。然后利用cck-8法分析评价a-f/e@m及相关对照材料的细胞毒性；利用激光共聚焦显微镜及流式细胞术检测小胶质细胞bv2对材料的吞噬情况；通过糖氧剥夺(ogd)离体脑缺血模型处理sy5y细胞，利用annexinv-fitc/pi细胞凋亡检测试剂盒检测材料对细胞凋亡水平的影响；通过transwell模拟体外血脑屏障，利用流式细胞术检测bv2细胞向m2极化的情况；利用激光共聚焦显微镜及流式细胞术评价材料对细胞内ros水平的影响；利用elisa试剂盒检测炎症相关因子tnf-α、il-1β和il-6的表达水平；利用流式细胞术评价了材料对细胞内线粒体膜电位的影响；利用流式细胞术评价了材料对细胞内钙离子浓度的影响；建立脑缺血再灌注(tmcao)模型，利用zea-longa评分实验评价材料对大鼠神经功能恢复的影响；利用ttc染色实验评价材料对大鼠脑梗死面积的影响；利用h&e染色实验评价材料对大鼠脑细胞的影响；利用t2磁共振(mr)成像系统评价材料对大鼠脑细胞的影响。
29、有益效果
30、(1)本发明工艺简单，所需反应条件简单，易于操作分离，具有良好的发展前景。
31、(2)本发明制备的纳米药物具有良好的稳定性、水溶性及生物相容性，为构建安全、高效的纳米药物提供了新思路。
32、(3)本发明制备的纳米药物具有较高的载药率，可穿越bbb，在脑缺血部位靶向聚集，高效发挥抗炎抗氧化功效并提高edv的生物利用度，为构建安全、智能、高效的药物载体提供了新思路。
33、(4)本发明制备的纳米药物一方面可以作用于小胶质细胞使其从促炎m1型转变为抗炎m2型，减少缺血再灌注后脑部氧化损伤，另一方面可以保护神经细胞线粒体恢复稳态。同时促进血管再生进一步减少缺血部位面积，从而增强治疗效果，可以实现抗氧化、抗炎、抗凋亡和促再生的联合治疗，具有潜在的临床应用价值。
1.一种含磷树状大分子纳米复合材料，其特征在于，所述复合材料以亚磷酸钠盐修饰的含磷树状大分子为载体，表面修饰纤连蛋白fn，并负载药物。
2.一种细胞膜仿生纳米材料，其特征在于，所述细胞膜仿生纳米材料包括巨噬细胞膜包覆权利要求1所述含磷树状大分子纳米复合材料。
3.一种细胞膜仿生纳米材料的制备方法，包括：
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中ak137与fn的质量比为12:1-2；所述fn溶液、ak137溶液的溶剂均为水；fn溶液浓度为1.5-3.5mg/ml、ak137溶液30-35mg/ml。
5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中混合为fn溶液逐滴加入ak137溶液中；室温搅拌反应时间为4-8h；所述离心为离心温度为4-10℃，以12000-14000g离心力离心10-15min，收集沉淀。
6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中ak137-fn复合物、药物的质量比为2-3：1；所述药物为依达拉奉edv。
7.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中混合为药物逐滴滴加到ak137-fn复合物溶液中，其中药物浓度为1-2mg/ml；所述药物的助溶剂为甲醇；所述室温搅拌反应时间为20-24h；所述离心为离心温度4-10℃，以1000-1500g离心力离心10-15min，去除沉淀。
8.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中含磷树状大分子纳米复合材料、细胞膜的质量比为1:1-2；所述细胞膜为raw细胞膜；所述挤出：使用滤膜孔径为400-600nm的avanti微型挤出器反复挤压11-15次。
9.一种权利要求2所述细胞膜仿生纳米材料在制备抗氧化、抗炎、抗凋亡和促再生的联合治疗药物中的应用。
10.一种权利要求2所述细胞膜仿生纳米材料在制备预防或治疗脑梗死、脑卒、脑细胞损伤药物中的应用。
