本发明属于生物工程，具体涉及粘质沙雷氏菌在联产灵菌红素和地尔硫卓中间体的应用。
背景技术：
1、灵菌红素(prodigiosins，pg)是一种由微生物产生的天然红色素，属于次级代谢产物。因其具有抗炎、抗菌、抗氧化、多种生物活性和抗肿瘤等效果而受到广泛关注。当前灵菌红素的主要生产方法是微生物发酵法，因灵菌红素的产量与培养基的组成和培养条件有密切联系，所以通过优化发酵液的成分、培养条件、培养环境以及培养时间来提高灵菌红素的产量。
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3、地尔硫卓是一种临床常用的心脑血管药物，药效良好且临床适用性广泛，在国内外市场前景非常可观。一般采用化学拆分法、不对称合成法和生物拆分法合成地尔硫卓。但是不对称合成反应条件苛刻，拆分使用试剂昂贵，成本较高，不符合工业化生产的要求，所以常采用操作简单且对环境友好的拆分法合成地尔硫卓。如何研究出一条更加适合大规模工业化生产、高效低毒、成本低、操作简单的工艺路线，得到了制药领域的普遍关注。而粘质沙雷氏菌生产的脂肪酶对合成路线上的反式-4-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯[(±)-mpgm]可进行拆分得到对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯[(2r,3s)-(-)-mpgm]，这是合成地尔硫卓的关键中间体。使用粘质沙雷氏菌发酵液直接对(±)-mpgm进行拆分，能够得到高产的灵菌红素和地尔硫卓关键中间体(2r,3s)-(-)-mpgm，缩短了生产周期，降低了生产成本。
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5、经检索，目前未见有粘质沙雷氏菌联产灵菌红素和地尔硫卓中间体的相关报道。
技术实现思路
1、发明目的：本发明要解决的问题是提供一种利用粘质沙雷氏菌联产灵菌红素和地尔硫卓中间体(2r,3s)-(-)-mpgm的方法，利用粘质沙雷氏菌发酵制备灵菌红素，同时利用粘质沙雷氏菌发酵液中的脂肪酶的脂肪酶拆分反式-4-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯[(±)-mpgm]得到对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯[(2r,3s)-(-)-mpgm]，提高生产效率，降低生产成本。
2、技术方案：为解决上述问题，本发明采取的技术方案如下：
3、粘质沙雷氏菌在联产灵菌红素和地尔硫卓中间体(2r,3s)-(-)-mpgm应用。
4、所述粘质沙雷氏菌分类命名为粘质沙雷氏菌lt-7(serratia marcescens lt-7)，已保藏于“中国典型培养物保藏中心”(简称cctcc)，保藏地址：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学山国典型培养物保藏中心，邮编：430072，保藏编号为cctcc no:m20231646，保藏日期为2023年9月7日。以下内容均以此菌株作为生产菌株。
5、具体的应用方法为，将粘质沙雷氏菌s.marcescens lt-7接种于固体培养基，再转接到种子培养基，最后接种于发酵培养基中好氧培养，再向发酵液中加入(±)-mpgm和甲苯，制备得到灵菌红素和地尔硫卓中间体(2r,3s)-(-)-mpgm。
6、本发明所述的粘质沙雷氏菌s.marcescens lt-7及其所述菌在制备灵菌红素和(2r,3s)-(-)-mpgm的应用，依次包括以下步骤：
7、1.培养基配制：
8、(1)斜面培养基成分：胰蛋白胨10g/l，nacl 10g/l，酵母粉5g/l，琼脂20g/l，余量为水，ph值6.0～7.0，优选为6.8；
9、(2)固体种子培养基：胰蛋白胨10g/l，nacl 10g/l，酵母粉5g/l，琼脂20g/l，ph值6.8，余量为水，ph值6.0～7.0，优选为6.8；
10、(3)液体种子培养基：胰蛋白胨15g/l，麦芽糖10g/l，ph值6.8，余量为水，ph值6.4～8.0，优选为6.8；
11、(4)发酵培养基：碳源5～15g/l，氮源10～20g/l，金属盐0.005～1g/l，ph值6.4～8.0，脯氨酸2～5g/l，溶剂为水。
12、其中所述碳源为甘蔗汁、糖蜜、蔗糖、甘露糖、甘油中的任意一种或几种的组合；优选糖蜜，所述糖蜜的添加量优选为10g/l；
13、所述氮源为胰蛋白胨、大豆蛋白胨、花生饼粉、黄豆饼粉的任意一种或几种的组合，优选胰蛋白胨，所述胰蛋白胨的添加量优选为15g/l；
14、所述的金属盐为硫酸镁，最优选硫酸镁0.8g/l；
15、最优选的发酵培养基如下：糖蜜10g/l，胰蛋白胨15g/l，硫酸镁0.8g/l，吐温-8025g/l，脯氨酸3g/l，溶剂为水。
16、2.菌种选择：
17、选择已保藏菌种粘质沙雷氏菌s.marcescens lt-7。
18、3.菌种活化：
19、将粘质沙雷氏菌s.marcescens lt-7菌种接种于斜面培养基，20～30℃静置培养18～34h，然后挑单菌落到普通固体培养基中进行三区划线，20～30℃静置培养18～34h得到活化菌种。
20、4.种子液制备：
21、挑取步骤3得到的活化菌种于无菌条件下接种1环于种子液的摇瓶中，置于温度为30℃，转速为200rpm的摇床中避光培养12h，得到种子液。
22、5.摇瓶发酵培养：
23、将步骤4中得到的种子液在无菌条件下以3％的接种量接种于发酵培养摇瓶中，置于温度为32℃，转速为250rpm的条件下避光培养36h。当发酵液中灵菌红素和(2r,3s)-(-)-mpgm浓度基本不再上升时，发酵停止。
24、6.发酵罐发酵培养：
25、将步骤4得到的种子液在无菌条件下以3％的接种量接入50l发酵罐中，发酵液总装液量为35l，发酵温度为32℃，搅拌速度为250rpm，ph为恒定的6.8，通气量为0.9～1.1vvm进行发酵，发酵时间为46h；当发酵液中灵菌红素和(2r,3s)-(-)-mpgm浓度基本不再上升时，发酵停止。
26、7.(2r,3s)-(-)-mpgm的制备：
27、发酵至38h时，向培养液中加入5～20g/l的(±)-mpgm和发酵液0.5～1倍体积的甲苯，继续在摇床上32℃，250rpm培养2-8h后，不变化停止培养。
28、8.灵菌红素和(2r,3s)-(-)-mpgm的提取：
29、(1)粗品制备：取粘质沙雷氏菌s.marcescens lt-7发酵液离心，将菌体用2倍甲醇浸提至菌体发白，与上清液合并后浓缩3-5倍，加入等体积的乙酸乙酯过夜萃取，取有机相过滤后旋转蒸发浓缩至浸膏状粗体物。
30、(2)灵菌红素和(2r,3s)-(-)-mpgm的提取：将(1)中的有机相用5％的nahso3洗涤，再用5％的nahco3洗涤，硫酸镁干燥后得到(2r,3s)-(-)-mpgm。以200-300目硅胶为固定相，石油醚：乙酸乙酯＝7：3为流动相，将上述剩余有机相用甲醇溶解后上样，采用硅胶柱层析法纯化灵菌红素收集对应rf值组分旋转蒸发浓缩后冷冻干燥24h，获得灵菌红素。
31、9.灵菌红素含量测定：
32、精密称取干燥恒重的灵菌红素标准品，配置成0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mg/ml的标准液，在535nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程，如图所示，并依据该标准曲线计算灵菌红素的含量。
33、10.灵菌红素的鉴定
34、采用高效液相色谱仪、红外光谱仪和核磁共振仪来鉴定粘质沙雷氏菌s.marcescens lt-7发酵产物。
35、取灵菌红素提纯产物10mg溶于100ml甲醇，调节ph至3，得到灵菌红素甲醇溶液其液相色谱结果如图1所示。
36、利用红外光谱仪鉴定粘质沙雷氏菌s.marcescens lt-7发酵灵菌红素提纯产物的红外图谱，取样品0.2mg与少量kbr研磨压片制样，然后用红外光谱仪测定样品的红外图谱，扫描范围4000～400cm-1(图2)。以cd3cl为溶剂，对粘质沙雷氏菌lt-7发酵提纯产物进行nmr1h和nmr13c检测。结果如图3和图4所示。
37、有益效果：
38、本发明首次筛选得到一株能够联产灵菌红素和地尔硫卓中间体(2r,3s)-(-)-mpgm的粘质沙雷氏菌s.marcescens lt-7，发酵培养基中灵菌红素的最高浓度为27.6g/l，地尔硫卓中间体(2r,3s)-(-)-mpgm的最高浓度为17.3g/l，最高转化率可以达到86.5％，大大缩短了生产周期，工艺简单，降低成本，这对于灵菌红素和地尔硫卓中间体(2r,3s)-(-)-mpgm的生产具有十分重要的社会和经济意义。
1.粘质沙雷氏菌在联产灵菌红素和地尔硫卓中间体中的应用，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌的分类命名为粘质沙雷氏菌serratia marcescens lt-7，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m20231646，保藏日期为2023年9月7日。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将粘质沙雷氏菌s.marcescens lt-7接种于发酵培养基中进行好氧发酵，再向发酵液中加入(±)-mpgm和甲苯，制备得到灵菌红素和地尔硫卓中间体(2r,3s)-(-)-mpgm。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基包括如下组分：
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用碳酸氢钠调节发酵液初始ph至6.0～7.0。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的好氧发酵，其培养条件为：温度为26～34℃，220～250rpm，培养时间为24～38h。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，当好氧发酵为摇瓶培养时，种子液的接种量为发酵液体积分数的2～4％，培养时间为24～38h。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，当好氧培养为发酵罐培养时，种子液的接种量为发酵液体积分数的3～6％，通气量为1.0～1.4vvm。
8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的好氧发酵为分批补料发酵。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的分批补料发酵是发酵至30h时补充糖蜜5～10g/l。
10.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，当发酵液中灵菌红素的产量不再增加时，向发酵液中加入(±)-mpgm和甲苯，所述(±)-mpgm的加入量为5～20g/l，甲苯的加入量为发酵液总体积的0.5～1倍，然后在32℃、250rpm的条件下继续培养2～3h制备地尔硫卓中间体(2r,3s)-(-)-mpgm。
