本发明涉及生物，尤其涉及一种磷酸化肽段的富集方法及其应用。
背景技术：
1、蛋白质磷酸化修饰是细胞中重要的翻译后修饰方式，对细胞分化、增值和信号转导具有关键的调控作用。磷酸化修饰主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上；其它氨基酸如组氨酸、精氨酸和赖氨酸在一些细胞中也有少量磷酸化修饰。磷酸化修饰的过程通常是由蛋白激酶催化atp的磷酸基团转移到底物蛋白上，而磷酸酶可去除磷酸化修饰，这两种酶协同调控细胞内的磷酸化水平。由于磷酸化修饰具有高度动态性、复杂性以及在细胞内的丰度较低等特征，所以检测和分析蛋白质的磷酸化肽段或磷酸化位点具有很大的技术困难，导致解析磷酸化信号通路及其作用机理一直是生物学研究领域的难点。
2、为了降低磷酸化肽段的复杂性程度，多数实验室是先通过液相色谱把蛋白质或多肽混合物预分馏成多个组分，再富集纯化磷酸化肽段。然而，这些方法有很多缺点，例如，色谱设备及其耗材价格较贵、操作技术难度较大、专业性较强、不适合所有实验室使用。
技术实现思路
1、为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种磷酸化肽段的富集方法及其应用。
2、在本领域的常规认知中，含有c18填料的固相萃取小柱通常显示一定的弱疏水性，较难和高度疏水性肽段(例如磷酸化的肽段)相结合，所以通常会选用其他材料的柱子进行磷酸化肽段的分离，但是本发明研究发现通过有机溶剂分级分离的流程/基于疏水性肽段特异性吸附和反相萃取的原理，采用含有c18的固相萃取小柱可以有效分离酶解样品中的磷酸化肽段，具有较高的回收率和纯度。在经过含有c18的固相萃取柱分离后，进一步结合肽段富集流程(例如采用金属氧化物富集磷酸化肽段)可以实现磷酸化肽段，尤其是膜蛋白等高度疏水性磷酸化肽段的高效富集，进行用于后续的研究过程中。
3、第一方面，本发明提供一种磷酸化肽段的富集方法，包括：
4、肽段分离和肽段富集；
5、所述肽段分离包括：采用spe小柱对待处理样品进行分级分离处理得到含肽段的混合物组分；
6、所述spe小柱为含有c18填料的spe小柱。
7、进一步地，所述肽段分离的洗脱流程包括：
8、采用洗脱液进行多次洗脱；收集所有洗脱液；
9、所述洗脱液中，以体积百分含量计，甲酸含量为0.1～1.5％；乙腈含量为5～100％。
10、进一步地，所述采用洗脱液进行多次洗脱包括：
11、分别采用不同乙腈浓度梯度的洗脱液进行洗脱；所述洗脱液中，以体积百分含量计，相邻乙腈浓度梯度之间差距为5～40％。
12、进一步地，所述肽段分离包括：清洗、平衡、上样、脱盐和洗脱。
13、进一步地，所述清洗包括：采用乙腈溶液清洗所述spe柱多次；所述乙腈溶液中乙腈的浓度为90～100％；和/或，
14、所述平衡包括：采用甲酸溶液平衡所述spe柱多次；
15、以体积百分含量计，所述甲酸溶液中甲酸的含量为0.2～1.5％；和/或，
16、所述上样包括：将所述待处理样品反复多次上样至所述spe小柱，每次上样后静置2～4分钟，例如可以上样5次以上；
17、所述脱盐包括：
18、采用甲酸溶液脱盐多次；
19、以体积百分含量计，所述甲酸溶液中甲酸的含量为0.2～1.5％。
20、进一步地，所述肽段富集包括：采用金属氧化物富集磷酸化肽段。
21、进一步地，所述金属氧化物包括：钛氧化物、锆氧化物、铝氧化物或铁氧化物中的一种或多种。
22、进一步地，所述肽段富集包括：
23、将经过所述肽段分离得到的肽段混合物真空浓缩后溶解于乙腈和三氟乙酸的混合溶液中得到富集液；
24、混合所述富集液和tio2悬浮液，震荡45～75分钟后离心除去上清，得到富集了磷酸化肽段的tio2珠；
25、将所述富集了磷酸化肽段的tio2珠清洗后采用洗脱溶液i和洗脱溶液ii进行洗脱，收集洗脱液；
26、所述洗脱液i以体积百分含量计，包括0.2～1.5％氨水和25～35％乙腈；
27、所述洗脱液ii以体积百分含量计，包括1～3％氨水和50～70％乙腈。
28、第二方面，本发明提供所述的富集方法在降低含肽段的混合物的复杂程度中的应用。
29、本发明进一步提供所述的富集方法在富集糖基化肽段或泛素化肽段中的应用。
30、本发明具备如下有益效果：
31、本发明根据肽段与不同柱子的结合特异性，采用双向(two-dimensional)纯化方法，分别包括肽段分离和肽段富集进行磷酸化肽段的纯化。其中采用含有c18填料的spe小柱进行肽段分离，结合有机溶剂分级分离的流程能够高效分离酶解样品中的肽段，尤其是高度疏水性磷酸化肽段，去除样品中的杂质。进而在后续的肽段富集过程中，通过金属氧化物进一步对磷酸化肽段进行富集，回收率高，并且富集产物中磷酸化肽段纯度较高，这对于蛋白质的磷酸化修饰研究具有重要意义。
1.一种磷酸化肽段的富集方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，所述肽段分离的洗脱流程包括：
3.根据权利要求2所述的富集方法，其特征在于，
4.根据权利要求1-3任一项所述的富集方法，其特征在于，所述肽段分离包括：清洗、平衡、上样、脱盐和洗脱。
5.根据权利要求4所述的富集方法，其特征在于，所述清洗包括：采用乙腈溶液清洗所述spe小柱多次；以体积百分含量计，所述乙腈溶液中乙腈的浓度为90～100％；和/或，
6.根据权利要求1-5任一项所述的富集方法，其特征在于，所述肽段富集包括：采用金属氧化物富集磷酸化肽段。
7.根据权利要求6所述的富集方法，其特征在于，所述金属氧化物包括：钛氧化物、锆氧化物、铝氧化物或铁氧化物中的一种或多种。
8.根据权利要求5所述的富集方法，其特征在于，所述肽段富集包括：
9.权利要求1-8任一项所述的富集方法在降低含肽段的混合物的复杂程度中的应用。
10.权利要求1-8任一项所述的富集方法在富集糖基化肽段或泛素化肽段中的应用。
