大体来说，本发明涉及用于基因组修饰的组合物和方法。
背景技术：
1、基因组编辑技术具有治疗多种疾病和病症的潜力，所述疾病和病症包括但不限于癌症，遗传病症和hiv/aids。体细胞的基因组编辑是治疗开发的有前途的领域，复杂的酶编辑工具crispr-cas9已被用于从人胚胎的种系中消除人β-球蛋白(hbb)基因(otieno，(2015)，j clin res bioeth 6：253.doi:10.4172/2155-9627.1000253)。但是，从历史上看，基因编辑技术的临床应用受到多种因素的限制，其中包括编辑事件的频率低、脱靶事件高或其组合。
2、因此，本发明的目的是提供用于基因递送和基因编辑的改进的组合物和方法。
技术实现思路
0、发明简述
1、提供了工程化转座子及其使用方法。转座子通常包括rna成分和蛋白质成分。rna成分可以包括例如dna靶向序列、一个或多个蛋白质结合基序以及待整合在dna靶位点上的目标核酸序列。通常将dna靶向序列、蛋白质结合基序和目标序列可操作地连接，以使它们可以与衍生自限制样内切核酸酶长散在(rle line)元件蛋白质的蛋白质成分结合并被逆转录，从而获得的cdna可以在dna靶位点整合到dna中，例如在细胞基因组中的dna。目标序列可以编码例如基因或其片段或功能性核酸。
2、参与结合蛋白质、蛋白质结合基序(pmb)的rna区段通常与蛋白质成分的rna结合结构域(结构域-1)、逆转录酶、接头结构域、内切核酸酶或其组合结合。
3、rna成分可以包括来自或衍生自亲本line或sine骨架的元件，并且rna成分的目标核酸序列通常与line或sine异源。在典型的实施方案中，dna靶向序列与亲本line或sine是异源的。rna成分可以包括例如来自或衍生自亲本line或sine元件的3'pbm序列，crispr/cas示踪序列、crispr/cas引导序列或其组合，来自或衍生自亲本line或sine元件的5'pbm序列，优选其中任何ires序列都是无功能的，核酶如丁型肝炎病毒样核酶，或其任何组合。
4、蛋白质成分通常衍生自rle line元件蛋白质，并且可以包括一个或多个dna结合结构域、一个或多个rna结合结构域、逆转录酶，接头结构域和内切核酸酶。通常，将dna结合结构域、rna结合结构域、逆转录酶、接头结构域和内切核酸酶可操作地连接，使得它们可以在dna靶位点结合rna成分和dna(例如细胞基因组dna)，促进rna成分逆转录为cdna，并将cdna在dna靶位点整合到dna中。通常，dna结合结构域相对于亲本line dna结合结构域是突变的，或者亲本dna结合结构域被备选的dna结合结构域取代。在一些实施方案中，dna结合结构域是来自另一种dna结合蛋白的dna结合结构域或其基序，例如螺旋-转角-螺旋、锌指、亮氨酸拉链、翼状螺旋、翼状螺旋-转角-螺旋、螺旋-环-螺旋，hmg-盒、wor3结构域、ob折叠结构域、免疫球蛋白折叠、b3结构域、tal效应子或rna导向结构域。通常，rna结合结构域、逆转录酶、接头结构域和内切核酸酶中的一个或多个的序列与line元件蛋白质的序列相同，或优选相对于亲本line元件蛋白质进行突变以改善与rna成分或靶dna的结合和/或酶活性。
5、在一些实施方案中，rna成分的亲本line或sine骨架和蛋白质成分的亲本line骨架是相同的line和/或sine源自line的祖先或是line的祖先。rna成分的rna序列、蛋白质序列的氨基酸序列或其组合可以是亲本骨架的重组序列和/或变体。
6、还提供了编码rna成分和蛋白质成分的载体，以及包括所述成分、载体和/或由此形成的工程化转座子的药物组合物。优选地，转座子可以在dna靶位点的整合反应期间形成生产性的4向连接。
7、还提供了使用方法。例如，将目标核酸序列引入一个或多个细胞的基因组中的方法，所述方法可以包括使一个或多个细胞与(i)rna成分或编码rna成分的载体和蛋白质成分或编码蛋白质成分的载体的组合；或(ii)包含rna成分和蛋白质成分的工程化转座子接触。可以在体外或体内接触细胞。在一些实施方案中，离体修饰的细胞随后被引入需要其的受试者中。在一些实施方案中，将组合物直接施用至需要其的受试者。
8、还提供了治疗疾病和病症的方法。在这样的用途中，目标核酸序列在细胞中的表达可以改善疾病或病症的一种或多种症状，或改善疾病或病症潜在的分子途径。在优选的实施方案中，修饰有效数量的细胞以治疗患有疾病或病症的受试者。
1.rna成分，其包含dna靶向序列，一个或多个蛋白质结合基序(pbm)以及待整合到dna靶位点中的目标核酸序列，其中所述dna靶向序列，蛋白质结合基序和目标序列可操作地连接，使得它们能够与源自亲本长散在(line)元件蛋白质的蛋白质成分结合并逆转录成cdna，所述cdna能够在dna靶位点整合到dna中。
2.根据权利要求1所述的rna成分，其中所述蛋白质成分包含rna结合结构域、接头结构域、逆转录酶、dna内切核酸酶中的一个或多个，其中所述一个或多个蛋白质结合基序将所述rna成分结合至所述蛋白质成分的所述rna结合结构域、接头结构域、逆转录酶、dna内切核酸酶或其组合。
3.根据权利要求1或2所述的rna成分，
4.根据权利要求1-3中任一项所述的rna成分，其中所述dna靶向序列与所述亲本line或sine是异源的。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的rna成分，其中所述目标序列编码基因、基因的片段或功能性核酸。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的rna成分，其包含来自或衍生自亲本line或sine元件的3′pbm序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的rna成分，其包含crispr/cas示踪序列、crispr/cas引导序列或其组合。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的rna成分，其包含来自或衍生自亲本line或sine元件的5′pbm序列。
9.根据权利要求8所述的rna成分，其中所述5′pbm包含非功能性ires序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的rna成分，其进一步包含核酶。
11.根据权利要求10所述的rna成分，其中所述核酶是丁型肝炎病毒样核酶。
12.根据权利要求2-10中任一项所述的rna成分，其中所述亲本line或sine是限制样内切核酸酶(rle)line。
13.根据权利要求10所述的rna成分，其中rle line是r2 line。
14.根据权利要求3-13中任一项所述的rna成分，其中所述rna成分的亲本line或sine骨架与所述蛋白成分的亲本line骨架是相同的line和/或所述sine源自line的祖先或是line的祖先。
15.蛋白质成分，其包含dna结合结构域、rna结合结构域、逆转录酶、接头结构域和内切核酸酶，其中所述dna结合结构域、rna结合结构域、逆转录酶、接头结构域和内切核酸酶可操作地连接，使得它们可以在dna靶位点与rna成分和dna结合，并促进rna成分逆转录成cdna，和cdna在dna靶位点整合到dna中。
16.根据权利要求15所述的蛋白质成分，其中所述rna成分包含dna靶向序列，一个或多个蛋白质结合基序以及待整合到所述dna靶位点的目标核酸序列。
17.根据权利要求15或16所述的蛋白质成分，其中所述rna成分包含来自或衍生自亲本line或sine骨架的元件，并且所述rna成分的目标核酸序列与所述line或sine异源；
18.根据权利要求15-17中任一项所述的蛋白质成分，其中所述dna结合结构域相对于亲本line dna结合结构域是突变的。
19.根据权利要求15-17中任一项所述的蛋白质成分，其中所述dna结合结构域由相对于亲本line dna结合结构域的备选dna结合结构域取代。
20.根据根据权利要求19所述的蛋白质成分，其中所述dna结合结构域是来自另一dna结合蛋白质的dna结合结构域。
21.根据权利要求19或20所述的蛋白质成分，其中所述dna结合结构域包含以下一种或多种：螺旋-转角-螺旋，锌指，亮氨酸拉链，翼状螺旋，翼状螺旋-转角-螺旋，螺旋-环-螺旋，hmg-盒，wor3结构域，ob折叠结构域，免疫球蛋白折叠，b3结构域，tal效应子或rna导向结构域。
22.根据权利要求15至22中任一项所述的蛋白质成分，其中所述rna结合结构域、逆转录酶、接头结构域和内切核酸酶中的一个或多个的序列与所述亲本line元件蛋白质的序列相同，或被突变以改善rna成分相对于亲本line元件蛋白质的结合或酶促活性。
23.根据权利要求17-22中任一项所述的蛋白质成分，其中所述亲本line或sine是限制样内切核酸酶(rle)line。
24.根据权利要求23所述的蛋白质成分，其中所述rle line是r2line。
25.根据权利要求17至24中任一项所述的蛋白成分，其中所述rna成分的亲本line或sine骨架和所述蛋白质成分的亲本line骨架是相同的line和/或所述sine源自line的祖先或是line的祖先。
26.载体，其编码根据权利要求1-14中任一项所述的rna成分。
27.载体，其编码根据权利要求15-25中任一项所述的蛋白质成分。
28.工程化转座子，其包含根据权利要求1-14中任一项的rna成分和根据权利要求15-25中任一项所述的蛋白质成分。
29.根据权利要求28所述的转座子，其中在整合反应期间在所述dna靶位点形成生产性的4向连接。
30.药物组合物，其包含根据权利要求1-14中任一项所述的rna成分，根据权利要求15-25中任一项所述的蛋白质成分，根据权利要求26所述的载体，根据权利要求27所述的载体，根据权利要求28或29所述的工程化转座子，或其任何组合。
31.将目标核酸序列引入一个或多个细胞的基因组中的方法，包括使所述一个或多个细胞接触(i)根据权利要求1-14中任一项所述的rna成分或根据权利要求26所述的载体与根据权利要求15-25中任一项所述的蛋白质成分或根据权利要求17所述的载体的组合；或(ii)根据权利要求28或29所述的工程化转座子。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述细胞在体外接触。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述细胞随后被引入受试者。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述细胞在体内接触。
35.根据权利要求31-34中任一项所述的方法，其中所述目标核酸序列在所述细胞中的表达改善了疾病或病症的一种或多种症状，或改善了疾病或病症潜在的分子途径。
36.根据权利要求35所述的方法，其中对有效数量的细胞进行修饰以治疗需要其的受试者。
