本技术涉及生物，尤其是涉及一种提高adc药物疗效的重组蛋白及其应用。
背景技术：
1、由于单抗癌症药物的引领，近年来在欧美快速发展的抗体药物偶联物(antibodydrug conjugate，adc)成为目前最前沿的医药技术之一。抗体药物偶联物一般由三个部分组成：1.专一性结合靶点的单抗；2.具有细胞毒性的小分子化学药物；3.链接小分子药物和单抗的链接体，也叫接头。
2、抗体药物偶联物利用单抗的靶点专一性和化学药物的细胞毒性来杀死肿瘤细胞。它的作用机制是：(1)抗体药物偶联物利用单抗特异地结合到肿瘤细胞上的靶点抗原；(2)抗体药物偶联物和靶点抗原的复合物通过靶点抗原介导内吞进入细胞；(3)抗体药物偶联物在细胞内降解，释放具有细胞毒的化学药物；(4)具有细胞毒的化学药物杀死肿瘤细胞。
3、抗体药物偶联物是否能成为安全有效的药物的核心是治疗窗口，由于连接的化学药物(例如毒素)毒性很强，给药浓度高会产生副作用，给药浓度低不起效果，找到治疗窗口是成药的关键。而治疗窗口的关键是抗体进入肿瘤细胞的效率，目前的天然抗体进入肿瘤细胞效率较低，致使很多靶点不能成药。
技术实现思路
1、本技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种提高adc药物疗效的重组蛋白及其应用。本技术首先通过肿瘤细胞表面靶向结构特异性识别目标细胞表面靶点，发挥常规抗体的杀伤活性，再通过细胞穿膜结构将adc药物带至肿瘤细胞内部，adc药物的毒素释放，导致肿瘤细胞死亡，采用本技术的重组蛋白的穿膜效率为50-90％，进而大大提升传统adc药物治疗窗口。
2、为实现上述目的，本技术采取的技术方案为：
3、第一方面，本技术提供了一种提高adc药物疗效的重组蛋白，所述重组蛋白包括肿瘤细胞表面靶向结构、细胞穿膜结构和毒素分子；
4、所述毒素分子与肿瘤细胞表面靶向结构和/或细胞穿膜结构连接融合；
5、所述肿瘤细胞表面靶向结构为能与肿瘤细胞表面靶点特异性结合的蛋白结构；
6、所述细胞穿膜结构为介导所述重组蛋白透过细胞膜进入细胞内部的蛋白结构。
7、本技术首先利用重组蛋白中的肿瘤细胞表面靶向结构特异性识别目标细胞表面靶点，发挥常规抗体的杀伤活性，然后通过细胞穿膜结构将毒素分子带入至肿瘤细胞内，毒素释放，以发挥杀伤肿瘤的作用，进而提高了adc药物疗效。
8、采用本技术结构的细胞穿膜结构的穿膜效率为50-90％，进而大大提升传统adc药物治疗窗口。
9、作为本技术所述重组蛋白的优选实施方式，所述细胞穿膜结构包括fab抗体-1、单链抗体-1、穿膜肽中的至少一种；
10、所述fab抗体-1含有重链可变区vh1-a和轻链可变区vl1-a；所述重链可变区vh1-a包含与序列seq id no:1～4至少一个具有至少95％同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区vl1-a包含与序列seq id no:5～8至少一个具有至少95％同一性的氨基酸序列；
11、所述单链抗体-1包含与序列seq id no:9～13至少一个具有至少95％同一性的氨基酸序列。
12、所述单链抗体-1包括单域结构域或scfv。
13、更优选地，所述单域结构域包含与序列seq id no:9～12至少一个具有至少95％同一性的氨基酸序列；scfv包含与序列seq id no:13具有至少95％同一性的氨基酸序列。
14、所述重链可变区vh1-a、轻链可变区vl1-a和单链抗体-1的氨基酸序列如下表1所示。
15、表1
16、
17、
18、更优选地，所述fab抗体-1含有重链可变区vh1-a和轻链可变区vl1-a；所述重链可变区vh1-a包含与序列seq id no:1或seq id no:2具有至少95％同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区vl1-a包含与序列seq id no:5或seq id no:6至少一个具有至少95％同一性的氨基酸序列；
19、所述单链抗体-1包含与序列seq id no:9具有至少95％同一性的氨基酸序列。
20、在一些具体实施例中，所述fab抗体-1中，所述重链可变区vh1-a为序列如seq idno:1或seq id no:2所示的氨基酸序列；
21、所述fab抗体-1中，轻链可变区vl1-a为序列如seq id no:5或seq id no:6所示的氨基酸序列；
22、所述单链抗体-1为序列如seq id no:9所示的氨基酸序列。
23、本技术对细胞穿膜结构进行优选，采用上述结构的细胞穿膜结构，可以将adc药物带至肿瘤细胞内部(穿膜效率可提升至50-90％)，adc药物的毒素释放，导致肿瘤细胞死亡，大大提升了传统adc药物治疗窗口，进而也可使不能成药的靶点可以成药。
24、作为本技术所述重组蛋白的优选实施方式，所述穿膜肽包括细胞穿膜肽hiv-1tat、细胞穿膜肽m918、细胞穿膜肽yta2、细胞穿膜肽yta4、细胞穿膜肽pep-1、细胞穿膜肽map、细胞穿膜肽cady、细胞穿膜肽pvec、细胞穿膜肽mpg、rvg-9r肽、狂犬病病毒肽rvg、peptide c105y、细胞穿膜肽tp10、细胞穿膜肽nls、kala两亲肽、蜂毒肽、多聚精氨酸(arg)n(n≥3)和氨基酸序列如seq id no:14～24任一所述的细胞穿膜肽中的至少一种。
25、上述穿膜肽的氨基酸序列如表2所示。
26、表2
27、
28、作为本技术所述重组蛋白的优选实施方式，所述肿瘤细胞表面靶向结构含有至少一个能特异性结合细胞表面靶点的蛋白结构，且所述至少一个能特异性结合细胞表面靶点的蛋白结构能结合至相同或不同的细胞表面靶点。
29、作为本技术所述重组蛋白的优选实施方式，所述肿瘤细胞表面靶点包括egfr、ceacam5、trop2、msln、cldn6、ror1、her2、her3、her4、flt-3、igf-1r、c-met、epha2、il13rα2、ron、vegfr、adora2a、fgfr、pdgfr、cd19、bcma、cd22、cd20、cd70、cd123、cd38、ceacam6、cd25、cd46、cd138、psma、muc1、muc16、gd2、mesothelin、gpc3、prame、cdh6、globo h、folr1、ido、gitrl、cd30、cd2/slam家族；pd-l1、cd47、cd73、cd33、tnfr2、wnt/βcatenin、toli样受体、b7-h3、趋化因子ccr、cxcr、frα、nectin-4、ror2、claudin18.2、cd133、cd44、epcam中的至少一种。
30、本技术所涉及的细胞表面靶点不仅仅局限于上述选择，还包括本领域中常见细胞表面靶点，细胞表面靶点还可以是例如信号传导蛋白、炎性介质、配体、细胞表面受体或其片段。
31、作为本技术所述重组蛋白的优选实施方式，所述肿瘤细胞表面靶点为msln、ceacam5、cldn6、ror1或trop2；所述肿瘤细胞表面靶向结构为可特异性结合细胞表面靶点的fab抗体-2、scfv结构域中的一种；
32、所述fab抗体-2含有重链可变区vh-b和轻链可变区vl-b；
33、所述重链可变区vh-b包含与序列为seq id no:25～29中至少一个具有至少95％同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区vl-b包含与序列为seq id no:30～34中至少一个具有至少95％同一性的氨基酸序列。
34、作为本技术所述重组蛋白的优选实施方式，所述重链可变区vh-b包含seq id no:25～29中至少一个氨基酸序列；
35、和/或，所述轻链可变区vl-b包含seq id no:30～34中至少一个氨基酸序列。
36、本技术仅是举例采用以上细胞表面靶点为msln、ceacam5、cldn6、ror1、trop2对应的细胞靶向结构，当细胞表面靶点采用其他种类时，可对应更换不同序列的细胞靶向结构，采用本技术的细胞靶向结构可以特异性识别目标细胞表面靶点，精准发挥常规抗体的杀伤活性。
37、在本技术的技术方案中，所述重链可变区vh-b、轻链可变区vl-b、scfv结构域的氨基酸序列如表3所示。
38、表3
39、
40、在一些具体实施例中，所述细胞表面靶向结构为至少含有一条重链可变区vh-b、至少一条轻链可变区vl-b的fab抗体-2。
41、作为本技术所述重组蛋白的优选实施方式，
42、所述肿瘤细胞表面靶向结构为fab抗体-2；
43、所述细胞穿膜结构为单链抗体-1；
44、且所述细胞穿膜结构连接至肿瘤细胞表面靶向结构的n端或c端。
45、作为本技术所述重组蛋白的优选实施方式，
46、所述肿瘤细胞表面靶向结构为fab抗体-2；
47、所述细胞穿膜结构为穿膜肽；
48、且所述细胞穿膜结构连接至肿瘤细胞表面靶向结构的c端。
49、作为本技术所述重组蛋白的优选实施方式，
50、所述肿瘤细胞表面靶向结构为scfv结构域；
51、所述细胞穿膜结构为单链抗体-1；
52、且所述细胞穿膜结构连接至肿瘤细胞表面靶向结构的c端。
53、作为本技术所述重组蛋白的优选实施方式，所述肿瘤细胞表面靶向结构和细胞穿膜结构通过连接肽进行连接。
54、作为本技术所述重组蛋白的优选实施方式，所述连接肽包括ggggs、ggggsgs、ggggsggs、ggggsggggs、ggggsggggsggggs、akttpkleegefsear、akttpkleegefsearv、akttpklgg、sakttpklgg、sakttp、radaap、radaaptvs、radaaaaggpgs、radaaaa(g4s)4、sakttpkleegefsearv、adaap、adaaptvsifpp、tvaap、tvaapsvfifpp、qpkaap、qpkaapsvtlfpp、akttpp、akttppsvtplap、akttapsvyplap、astkgp、astkgpsvfplap、genkveyapalmals、gpakeltplkeakvs、gheaaavmqvqypas、akttap中的至少一种。
55、本技术所涉及的连接肽不仅仅局限于上述列举，连接肽还包括在体内可断裂的肽连接肽、蛋白酶(如mmp)敏感性连接肽、可以通过还原而断裂的基于二硫键的连接肽等，或本领域已知的任何可断裂的连接肽，都在本技术的保护范围之内。
56、作为本技术所述重组蛋白的优选实施方式，所述毒素分子包括放射性同位素、抗代谢物、dna烷化剂、dna交联剂、dna嵌入剂、拓扑异构酶抑制剂、紫杉烷、长春花生物碱、美登素生物碱、秋水仙碱、鬼臼毒素、灰黄霉素、spdb、smcc、sn38中的至少一种。
57、本技术所提及的毒素分子的种类不仅仅局限于上述举例，还包括了本领域中常规使用的毒素分子都在本技术毒素分子的保护范围之内。
58、在一些具体实施例中，毒素分子通过连接子链接于肿瘤细胞表面靶向结构和/或细胞穿膜结构。
59、第二方面，本技术提供了编码上述的重组蛋白的核酸分子。
60、第三方面，本技术提供了包含上述核酸分子的表达载体。
61、在一些具体实施例中，所述表达载体包括pks001。
62、本技术所涉及表达载体不仅仅局限于上述列举的载体，还包括本领域常用于克隆和表达所述核酸分子的表达载体，都在本技术的保护范围之内。
63、第四方面，本技术提供了包含上述核酸分子或表达载体的宿主细胞。
64、作为本技术所述宿主细胞的优选实施方式，所述宿主细胞是真核的，优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞或适用于制备抗体或融合蛋白的其他细胞。
65、在一些具体实施例中，所述宿主细胞选自大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体的其它细胞。
66、第五方面，本技术提供了一种抗体药物偶联物，所述抗体药物偶联物包含上述重组蛋白和治疗肿瘤的药物。
67、第六方面，本技术提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述抗体药物偶联物和药学上可接受的药物辅料。
68、第七方面，本技术提供了上述抗体药物偶联物或药物组合物在制备预防或治疗肿瘤药物或组合产品中的用途。
69、作为本技术所述用途的优选实施方式，所述药物或组合产品与一种或多种其它疗法联合施用。
70、作为本技术所述用途的优选实施方式，所述肿瘤包括肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、胃癌、黑色素瘤、骨癌、皮肤癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、肛门癌、恶性血液病、胆囊癌、胆管癌、头颈癌、胶质瘤、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体癌、骨肉瘤、食道癌、小肠癌、头颈鳞状细胞癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、骨髓瘤、淋巴瘤中的一种。
71、本技术还涵盖本文所述的任何实施方案的任意组合。本文所述的任何实施方案或其任何组合适用于本文所述的任何和所有重组蛋白或其片段或药物组合物或组合产品或试剂盒、方法和用途。
72、与现有技术相比，本技术具有以下有益效果：
73、本技术提供了一种提高adc药物疗效的重组蛋白及其应用，本技术首先利用重组蛋白中的肿瘤细胞表面靶向结构特异性识别目标细胞表面靶点，发挥常规抗体的杀伤活性，然后通过细胞穿膜结构将毒素分子带入至肿瘤细胞内，毒素释放，以发挥杀伤肿瘤的作用，进而提高了adc药物疗效。其中，采用本技术结构的细胞穿膜结构的穿膜效率可提升至50-90％，进而提升传统adc药物治疗窗口。
1.一种提高adc药物疗效的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白包括肿瘤细胞表面靶向结构、细胞穿膜结构和毒素分子；
2.如权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述细胞穿膜结构包括fab抗体-1、单链抗体-1、穿膜肽中的至少一种；
3.如权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于，所述穿膜肽包括细胞穿膜肽hiv-1tat、细胞穿膜肽m918、细胞穿膜肽yta2、细胞穿膜肽yta4、细胞穿膜肽pep-1、细胞穿膜肽map、细胞穿膜肽cady、细胞穿膜肽pvec、细胞穿膜肽mpg、rvg-9r肽、狂犬病病毒肽rvg、peptidec105y、细胞穿膜肽tp10、细胞穿膜肽nls、kala两亲肽、蜂毒肽、多聚精氨酸(arg)n(n≥3)和氨基酸序列如seq id no:14～24任一所述的细胞穿膜肽中的至少一种。
4.如权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述肿瘤细胞表面靶向结构含有至少一个能特异性结合细胞表面靶点的蛋白结构，且所述至少一个能特异性结合细胞表面靶点的蛋白结构能结合至相同或不同的细胞表面靶点。
5.如权利要求4所述的重组蛋白，其特征在于，所述肿瘤细胞表面靶点包括egfr、ceacam5、trop2、msln、cldn6、ror1、her2、her3、her4、flt-3、igf-1r、c-met、epha2、il13rα2、ron、vegfr、adora2a、fgfr、pdgfr、cd19、bcma、cd22、cd20、cd70、cd123、cd38、ceacam6、cd25、cd46、cd138、psma、muc1、muc16、gd2、gpc3、prame、cdh6、globo h、folr1、gitrl、cd30、cd2/slam家族；pd-l1、cd47、cd73、cd33、tnfr2、wnt/βcatenin、toli样受体、b7-h3、趋化因子ccr、cxcr、frα、nectin-4、ror2、claudin18.2、cd133、cd44、epcam中的至少一种。
6.如权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述肿瘤细胞表面靶向结构为可特异性结合细胞表面靶点的fab抗体-2或scfv结构域；
7.如权利要求6所述的重组蛋白，其特征在于，
8.如权利要求6所述的重组蛋白，其特征在于，
9.如权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述肿瘤细胞表面靶向结构和细胞穿膜结构通过连接肽进行连接；
10.如权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述毒素分子包括放射性同位素、抗代谢物、dna烷化剂、dna交联剂、dna嵌入剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白抑制剂、紫杉烷、长春花生物碱、美登素生物碱、秋水仙碱、鬼臼毒素、灰黄霉素、spdb、smcc、sn38中的至少一种。
11.一种抗体药物偶联物，其特征在于，所述抗体药物偶联物包含权利要求1～10任一项所述的重组蛋白和治疗肿瘤的药物。
12.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求11所述的抗体药物偶联物和药学上可接受的药物辅料。
13.如权利要求11所述的抗体药物偶联物或如权利要求12所述的药物组合物在制备预防或治疗肿瘤药物或组合产品中的用途。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述药物或组合产品与一种或多种其它疗法联合施用。
15.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述肿瘤包括肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、胃癌、黑色素瘤、骨癌、皮肤癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、肛门癌、恶性血液病、胆囊癌、胆管癌、头颈癌、胶质瘤、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体癌、骨肉瘤、食道癌、小肠癌、头颈鳞状细胞癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、骨髓瘤、淋巴瘤中的一种。
