本发明属于食品添加剂，具体涉及从中药胡椒根中分离得到的9个羟基酰胺生物碱，并研究了其在抗氧化，酪氨酸酶抑制活性方面的用途。
背景技术：
：：1、胡椒(pipernigrum l.)为胡椒科(piperaceae)胡椒属藤本植物，广泛种植于热带地区，我国台湾、福建及广东等省区均有栽培。胡椒根的主要成分为酰胺生物碱，具有温经通络、祛寒除痹的功效。胡椒根和胡椒的果实均可以食用，为日常餐桌上必不可少的调料。2、食品中的氧化反应会导致生物分子的转化和产品质量的恶化。这些反应继续加速，直到敏感物质被完全氧化，因此开发具有显著抗氧化性能的新型无毒食品添加剂至关重要。酶促褐变是食品工业中的一个重要问题，特别是对于在收获后处理和加工过程中受损的水果和蔬菜。减少酶促褐变的一个非常有效的方法是抑制关键多酚氧化酶的活性，如酪氨酸酶。3、本发明从胡椒根中寻找到新的抗氧化以及具有酪氨酸酶抑制活性的羟基酰胺生物碱化合物，并且提供该类羟基酰胺生物碱化合物的提取、制备方法。技术实现思路1、本发明的目的在于提供9个从胡椒科胡椒属植物胡椒(piper nigruml.)的根中分离得到的羟基酰胺生物碱类化合物，提供该类羟基酰胺生物碱化合物的提取、制备方法，还提供其在抗氧化，酪氨酸酶抑制方面的用途。所述羟基酰胺生物碱化合物结构如图所示：2、3、本发明包括如下制备技术方案：4、利用胡椒根制备酰胺生物碱类化合物的方法，包括以下步骤：用70％的乙醇提取干燥的胡椒根，减压蒸发干燥，得到粗提物浸膏。粗提物浸膏用水混悬，用正丁醇对其进行萃取3-4次。将萃取后的浸膏经硅胶柱色谱处理并以二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱，得到3个级分fr.a-c。所得级分fr.b经聚酰胺柱色谱进一步分离，分别用乙醇-水系统洗脱，得到fr.b1、fr.b2和fr.b3。5、所得级分fr.b1经hp20柱色谱以乙醇-水系统进行梯度洗脱，经hplc分析进行合并共得到5个级分fr.b1.1-fr.b1.5；所得级分fr.b1.1-fr.b1.5经ods柱色谱以乙醇-水系统进行梯度洗脱，经hplc分析进行交叉合并共得到4个级分fr.1-4；6、所得级分fr.3经硅胶柱色谱以石油醚-丙酮系统10:1-1:1和二氯甲烷-甲醇系统30:1-10:1进行梯度洗脱，共得到25个样品，后经硅胶薄层检识和hplc分析进行合并得到12个级分fr.3.1-3.12；所得级分fr.2经硅胶柱色谱以石油醚-丙酮系统10:1-1:1和二氯甲烷-甲醇系统30:1-8:1进行梯度洗脱，共得到30个样品，后经硅胶薄层检识和hplc分析进行合并得到10个级分fr.2.1-2.10；所得级分fr.1经硅胶柱色谱以石油醚-丙酮系统3:1-1:1和二氯甲烷-甲醇系统30:1-5:1进行梯度洗脱，共得到12个样品，后经硅胶薄层检识和hplc分析进行合并得到6个级分fr.1.1-1.6；7、利用制备hplc对级分fr.3.4以甲醇-水系统42:58进行分离，得到6个级分fr.3.4.1-fr.3.4.6；利用制备hplc对级分fr.2.6以甲醇-水系统35:65进行分离，得到6个级分fr.2.6.1-fr.2.6.6；利用制备hplc对级分fr.2.4以甲醇-水系统35:65进行分离，得到8个级分fr.2.4.1-fr.2.4.8；利用制备hplc对级分fr.1.2以甲醇-水系统25:75进行分离，得到5个级分fr.1.2.1-fr.1.2.5；利用制备hplc对级分fr.1.5以甲醇-水系统25:75进行分离，得到4个级分fr.1.5.1-fr.1.5.4；8、利用半制备hplc对级分fr.3.4.2以乙腈-水系统32:68进行洗脱，得到化合物3；利用半制备hplc对级分fr.2.6.1以乙腈-水系统25:75进行洗脱，得到化合物2，利用相同方法，对fr.2.6.3进行分离得到化合物4和化合物5；用半制备hplc对级分fr.1.2.1以乙腈-水系统20:80进行洗脱得到化合物1，对级分fr.1.5.2以乙腈-水系统18:82进行洗脱，化合物6。9、利用手性色谱柱对化合物1、2、3进行手性拆分分别得到了化合物1a/1b、2a/2b、3a/3b。其手性拆分方法为：化合物1利用daicel chiralpak ic手性色谱柱，流动相为1:1的正己烷-异丙醇混合溶剂，流速为0.3ml/min，紫外检测器检测波长为210nm；化合物2利用daicel chiralpakad-h手性色谱柱，流动相为1:1的正己烷-异丙醇混合溶剂，流速为0.4ml/min，紫外检测器检测波长为210nm；化合物3利用daicel chiralpak ic手性色谱柱，流动相为1:1的正己烷-异丙醇混合溶剂，流速为0.4ml/min，紫外检测器检测波长为210nm。10、本发明所述的提取、制备方法，适用于胡椒科胡椒属植物胡椒(pipernigrum l.)。11、本发明中所述的手性拆分条件，适用于化合物1-3。12、本发明所得化合物的结构鉴定结果如下：13、利用紫外光谱、高分辨质谱、一维和二维nmr技术对化合物1-6的平面结构及相对构型进行确定。通过比较实测ecd和计算ecd谱图，对拆分后的光学纯化合物1a/1b、2a/2b、3a/3b的绝对构型进行确定(如表1-表3)。14、化合物1平面结构：白色粉末；易溶于甲醇，难溶于水。hr-esims给出准分子离子峰m/z 316.1151[m+na]+(calcd for c15h19no5na,316.1155)，结合1h、13c nmr数据确定其分子式为c15h19no5。1h nmr(600mhz,cdcl3)谱中，1hnmr(table 1)显示了一组1,3,4-三取代芳环δh 6.78(1h,d,j＝8.0hz),6.94((1h,d,j＝1.6hz),6.82(1h,dd,j＝8.0,1.6hz)以及两个亚甲二氧基质子信号δh 5.95(2h,d,j＝1.7hz)。1h nmr谱还显示了两个邻二醇质子信号δh4.39(1h,d,j＝5.5,hz),4.58(1h,d,j＝9.8,2.0hz)及一个哌啶环质子信号δh 3.34(1h,dt,j＝12.5,6.0hz),3.72(1h,dt,j＝12.5,4.0hz),3.26(1h,ddd,j＝13.6,6.8,3.8hz),3.72(1h,ddd,j＝13.6,6.8,3.8hz),1.52(3h,overlap),1.61(1h,m),1.40(1h,m),1.21(1h,m)(table s1)。13c nmr结合hsqc谱分析表明15个碳信号，包括哌啶基团的羰基碳、6个芳族碳、2个连氧亚甲基碳、1个亚甲二氧基碳和5个sp3碳。1h-1h cosy确定了三种自旋系统：一种是从h-1'到h-5'的哌啶环基团的质子，一种是h-2-h-3的两个连氧碳基团的质子，另一种是h-8-h-9的芳香族的质子。此外，从h-10到c-6、7的hmbc相关性表明亚甲二氧基连接在苯环上。h-1'到h-5'的1h-1h cosy相关以及h-2、3、1'、5'/c-1、h-2/c-4以及h-3/c-4的hmbc相关性建立了在c-2处连接的哌啶酰胺和在c-3处连接的亚甲二氧基苯基片段。根据以上信息，化合物1的平面结构被确定为1-[1-氧代-2,3-二羟基-3(3,4-亚甲二氧基苯基)]-哌啶。化合物1的相对构型：通过丙叉实验和丙叉衍生物的noe谱图确定邻二醇的相对构型。因此，1的相对构型为2s*，3r*。由于弱的cd cotton效应和可忽略的旋光度值，因此使用手性hplc柱将化合物1拆分为约1：1比例的一对对对映体(1a/1b)。用snatzke方法确定了化合物1a/1b的绝对构型。1a与mo2(oac)4的络合物在310-320nm处产生负的cotton效应，根据snatzke提出的经验规则，确定1a的绝对构型为2s，3r。同样，1b与mo2(oac)4的络合物在310-320nm处产生正的cotton效应，根据snatzke提出的经验规则，确定1a的绝对构型为2r，3s。通过比较cam-b3lyp/6-311+g(2d,p)水平上的实验和计算的ecd光谱，进一步证实了它们的绝对构型。化合物1的结构如下所示：15、16、化合物2的平面结构：淡黄色油状物质。hr-esims给出准分子离子峰m/z 348.1810[m+na]+(calcd for c19h26no5na,348.1805)，结合1h、13c nmr数据确定其分子式为c19h26no5。1h和13c nmr分析表明化合物2的结构与胡椒酰胺相似。它们之间唯一的结构差异是c-6、7处的官能团，其中胡椒酰胺片段的双键被还原为邻二醇基团。通过丙叉实验和丙叉衍生物的noe谱图确定临二醇的相对构型。使用手性hplc柱将化合物5以约1:1的比例分离成一对对映体(2a/2b)，以及2a(6s,7s)的绝对构型和2b(6r,6r)经snatzke法确认。通过比较cam-b3lyp/6-311+g(2d,p)水平上的实验和计算的ecd光谱，进一步证实了它们的绝对构型。化合物2结构如下所示：17、18、化合物3的平面结构：白色粉末。hr-esims给出准分子离子峰(m/z 316.1151[m+na]+)，结合1h、13c nmr数据确定其分子式为c15h19no5。1h和13c nmr分析表明1h和13c nmr分析表明化合物3和化合物1的结构彼此相似，均存在亚甲二氧基、苯基、邻位二醇和哌啶酰胺部分。它们的邻位二醇构型不同。通过丙叉实验和丙叉衍生物的noe谱图确定临二醇的相对构型。使用手性hplc柱将化合物3以约1:1的比例分离成一对对映体(3a/3b)，以及3a(2r，3r)1-[1-氧代-2,3-二羟基-3(3,4-亚甲二氧基苯基)]-哌啶的绝对构型和3b(2r，3r)1-[1-氧代-2,3-二羟基-3(3,4-亚甲二氧基苯基)]-哌啶经snatzke法确认。通过比较cam-b3lyp/6-311+g(2d,p)水平上的实验和计算的ecd光谱，进一步证实了它们的绝对构型。化合物3结构如下所示：19、20、化合物4的平面结构：白色粉末。hr-esims给出准分子离子峰(m/z 262.1450[m+h]+)，结合1h、13c nmr数据确定其分子式为c15h19no3。1h和13c nmr分析表明1h和13cnmr分析表明化合物4和1-[1-氧代-3(3,4-亚甲基二氧苯基)-2z-丙烯基]-哌啶的结构彼此相似，除了3,4亚甲二氧基苯基外。通化合物4中的亚甲二氧基分裂成甲氧基和羟基。确定化合物4的结构为1-[1-氧代-3(3-甲氧基-4-羟基苯基)-2z-丙烯基]-哌啶。化合物4结构如下所示：21、22、化合物5的平面结构：白色粉末。hr-esims给出准分子离子峰(m/z 254.1156[m+na]+)，结合1h、13c nmr数据确定其分子式为c15h19no3。1h和13c nmr分析表明1h和13c nmr分析表明化合物5和1-(1-氧代-3-苯基-2e-丙烯基)-哌啶-的结构彼此相似，化合物5的苯基上的c-6位被羟基取代，这通过羟基上的氢质子与c6和c7的hmbc相关性进一步证明。确定化合物5的结构为1-[1-氧代-3(3-羟基苯基)-2e-丙烯基]哌啶。化合物5结构如下所示：23、24、化合物6的平面结构：白色粉末。hr-esims给出准分子离子峰(m/z 282.1464[m+na]+)，结合1h、13c nmr数据确定其分子式为c16h21no2。1h和13c nmr分析表明1h和13c nmr分析表明化合物6和1-[1-氧代-3(3,4-亚甲基二氧苯基)-2e-丙烯基]-哌啶的结构彼此相似，除了用羟基代替芳香环上取代的亚甲二氧基之外。这通过羟基上的氢质子与c6和c7的hmbc相关性进一步证明。确定化合物6的结构为1-[1-氧代-3(4-羟基苯基)-2e-丙烯基]-哌啶。化合物6结构如下所示：25、26、表1化合物1-3在cdcl3中1h(600mhz)nmr数据27、28、29、表2化合物4-6在cdcl3中1h(600mhz)nmr数据30、31、表3化合物1-6在cdcl3中13c(150mhz)nmr数据32、33、34、本发明还提供所述化合物1、2、3、4、5、6，在制备新型食品添加剂和防腐剂方面的应用。35、本发明的有益效果：36、对发明所述9个新的酰胺生物碱类化合物对抗氧化，抗酪氨酸酶活性进行了考察，实验结果表明化合物4、5、6有显著的抗氧化活性，化合物1-6有较强的抗酪氨酸酶活性。因此本发明所述的新的酰胺生物碱类化合1-6，具有新型食品添加剂和防腐剂用途，本发明为食品领域提供新的酰胺生物碱类化合物，其优点在于，所述化合物均为新化合物，化合物特点鲜明为酰胺生物碱易于分离纯化，同时有较好的抗氧化，抗酪氨酸酶活性为添加剂和防腐剂新的化合物类型，具有进一步开发的价值。此外本发明方法设计合理，具有工艺过程简单、成本低和可工业化生产的特点。当前第1页12当前第1页12
技术特征：1.胡椒根中羟基酰胺生物碱，其特征在于，所述羟基酰胺生物碱的结构如下所示：
2.根据权利要求1所述的胡椒根中羟基酰胺生物碱，其特征在于，所述胡椒根来自胡椒科胡椒属植物胡椒。
3.权利要求1或权利要求2所述的胡椒根中羟基酰胺生物碱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，干燥的胡椒根以70-80％工业乙醇回流提取2-3次；二氯甲烷-甲醇系统的梯度为100:0-1:1。。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，级分frs.b经聚酰胺柱色谱以乙醇-水系统20:80-90:10进行梯度洗脱，且采用的乙醇的浓度为20％-90％。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，级分fr.b1经hp20柱色谱以乙醇-水系统进行梯度洗脱，且采用的乙醇的浓度为10％-80％。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，级分fr.b1.3-fr.b1.5经ods柱色谱以乙醇-水系统进行梯度洗脱，且采用的乙醇的浓度为35％-85％。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，采用的手性拆分方法为：化合物1利用daicel chiralpak ic手性色谱柱，流动相为1:1的正己烷-异丙醇混合溶剂，流速为0.3ml/min，紫外检测器检测波长为210nm；化合物2利用daicel chiralpakad-h手性色谱柱，流动相为1:1的正己烷-异丙醇混合溶剂，流速为0.4ml/min，紫外检测器检测波长为210nm；化合物3利用daicelchiralpak ic手性色谱柱，流动相为1:1的正己烷-异丙醇混合溶剂，流速为0.4ml/min，紫外检测器检测波长为210nm。
9.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1或权利要求2所述的胡椒根中羟基酰胺生物碱1a/1b、2a/2b、3a/3b、4、5、6或其在药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或赋形剂。
10.权利要求1所述的胡椒根中羟基酰胺生物碱或权利要求9所述的药物组合物在制备食品添加剂或防腐剂中的应用。
技术总结本发明属于食品添加剂技术领域，具体涉及从胡椒科(Piperaceae)植物胡椒(Pipernigrum L.)的根中提取分离得到的酰胺生物碱。通过将胡椒根粗提物依次经硅胶柱色谱，聚酰胺柱色谱，HP20柱色谱，ODS柱色谱，HPLC分离的色谱方法进行分离，最终得到9个羟基酰胺生物碱。本发明还涉及对该类化合物的抗氧化和酪氨酸酶抑制作用进行考察。本发明制备方法简单，重现性好，所得化合物纯度高，获得的化合物具有抗氧化和酪氨酸酶抑制作用，可开发成为天然食品添加剂和防腐剂。
技术研发人员：宋少江,黄肖霄,徐志勇,白明,喇常盛
受保护的技术使用者：沈阳药科大学
技术研发日：技术公布日：2024/4/29
