本发明涉及微载体制备，尤其是涉及一种具有骨髓间充质干细胞特异性粘附能力的聚半乳糖醛酸微载体及其制备方法。
背景技术：
1、微载体是一种直径在60-–600μm的微珠，适用于贴壁细胞的生长，由于微球结构具有非常大的比表面积，相比于平面培养具有更好的增殖效果，在干细胞需求量大的领域具有不可替代的作用。聚半乳糖醛酸(pga)是一种天然多糖材料，从果胶中提取，生物相容性良好，而且pga的羧基结构丰富，在多价金属阳离子的螯合作用下快速成胶，非常适合制备微球结构，同时pga的活性基团也为进一步改性提供了可能。
2、两性离子聚合物是一种有效的抗污材料，在单元结构内带有一对相反电荷的基团，更有利于形成水化层，而水化层阻隔了蛋白质和细胞对材料的直接接触，从而明显地阻碍了细胞粘附，形成对细胞的普遍性抵抗能力。
3、生长因子是一种高效的促进细胞粘附的蛋白质，随着多肽的发展，细胞选择性多肽逐渐成为研究的新热点，由于传统多肽针对大部分细胞都具有强力的作用而缺乏特异性，所以细胞选择性多肽在制备智能响应性材料上具有更为突出的效果，在实现目的细胞粘附的同时尽可能地避免对其他细胞的影响。
4、现有技术仍然集中在促进细胞粘附上，通常选用生长因子或阳离子聚合物提高微球表面的生物活性，但诸如骨髓间充质干细胞的提取需要预先将干细胞从骨髓中提取再进行扩增，缺乏一种直接有效的提取方式实现细胞的快速获得。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种具有骨髓间充质干细胞特异性粘附能力的聚半乳糖醛酸微载体，本发明提供的微载体同时具备了良好的抗非目的细胞黏附效果和骨髓间充质干细胞(bmsc)粘附能力，实现对细胞的特异选择能力。
2、本发明旨在解决现有商业微载体无法针对某种目的细胞具有特异性粘附的问题。传统微载体通过各种表面优化得到的高生物活性对细胞没有筛选能力，所有细胞可以无差别的黏附在材料表面。但在干细胞提取，组织工程等应用中，只需要对某一种目的细胞具有响应，普适性的粘附效果反而会阻碍目的细胞的粘附，增殖或分化，从而降低使用效果。
3、本发明通过调节微载体的表面性质，对抗粘附性能和促粘附性能进行调控，得到可以屏蔽非目的细胞和粘附目的细胞的选择性微载体，用于干细胞的提取和培养。
4、本发明旨在混合细胞环境中针对特定细胞具有良好粘附能力的微载体，从而缩短干细胞培养流程。
5、本发明通过pga接枝两性离子化合物构建一种抗污性的材料，以此对细胞粘附产生阻碍，避免非目的细胞的粘附；另外pga同样通过开环反应接枝gma，并通过gma上的不饱和双键进行点击化学反应实现细胞选择性多肽的固定，从而通过多肽的选择实现针对目的细胞的特异性粘附。首先，我们通过原子转移自由基聚合将dmaps上的c＝c键与多糖上的-oh键反应，得到两性离子接枝聚半乳糖醛酸(pga-dmaps)；其次通过gma的开环反应与多糖上-oh的反应，将不饱和双键引入到pga中；然后将合成得到的两种单体通过钙离子的螯合作用形成微载体；最后通过固相合成法得到的半胱氨酸接枝的e7多肽(e7-cys)，并将合成的微载体浸没其中通过紫外光催化固定到微球表面得到细胞选择性微载体。
6、本发明提供了一种具有骨髓间充质干细胞特异性粘附能力的聚半乳糖醛酸微载体的制备方法，包括如下步骤：
7、a)聚半乳糖醛酸溶液、dmaps、aps和temed混合，在惰性气体保护下反应，反应产物经透析、冻干得到pga-dmaps；
8、b)聚半乳糖醛酸溶液和gma在惰性气体保护下反应，反应产物经沉淀、透析，冻干，即得pgama；
9、c)将pga-dmaps和pgama混合，滴加到接收液中，经配位偶联反应，制备得到微载体；
10、d)将所述微载体浸没在e7-cys溶液中，紫外灯照射，即得。
11、本发明提供的具有骨髓间充质干细胞特异性粘附能力的聚半乳糖醛酸微载体的制备方法首先聚半乳糖醛酸溶液、dmaps、aps和temed混合，在惰性气体保护下反应。更优选的，将dmaps、aps和temed加入聚半乳糖醛酸溶液中。
12、本发明首先制备聚半乳糖醛酸溶液；本发明所述聚半乳糖醛酸水溶液；所述聚半乳糖醛酸溶液的浓度为1～2wt％；优选为1～1.8wt％。上述溶液优选采用碱调节ph至8；所述碱包括但不限于氢氧化钠。
13、本发明dmaps([2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵)、aps(过硫酸铵)和temed(n,n,n',n'-四甲基乙二胺)为本领域技术人员熟知的市售即可。
14、按照本发明，所述聚半乳糖醛酸的质量g、dmaps的质量g、aps的质量mg和temed的体积μl的比为(0.5～1.0)：(0.3～0.5)：(15～25)：(15～25)。
15、一些优选实施方式中，所述聚半乳糖醛酸的质量g、dmaps的质量g、aps的质量mg和temed的体积μl的比为(0.5～0.8)：(0.3～0.4)：(17～22)：(17～23)。
16、一些优选实施方式中，所述聚半乳糖醛酸的质量g、dmaps的质量g、aps的质量mg和temed的体积μl的比为0.5：0.35：20：20。
17、本发明所述反应优选在惰性气体保护下反应；所述惰性气体为氮气；所述反应温度为25～35℃；反应时间为12～24h。
18、一些实施例中，所述反应温度为27～32℃；反应时间为12～20h。
19、一些实施例中，所述反应温度为28～32℃；反应时间为12～18h。
20、反应结束后，在蒸馏水中透析，透析的天数为3天，而后冻干，即得。本发明所述冻干参数优选为零下八十度冷冻，随后在零下五十度，真空度5pa，冻干三天。
21、聚半乳糖醛酸溶液和gma(甲基丙烯酸缩水甘油酯)在惰性气体保护下反应。
22、本发明首先制备聚半乳糖醛酸溶液；本发明所述聚半乳糖醛酸水溶液；所述聚半乳糖醛酸溶液的浓度为1～2wt％；优选为1～1.8wt％。上述溶液优选采用碱调节ph至10；所述碱包括但不限于氢氧化钠。
23、按照本发明，所述聚半乳糖醛酸和gma的摩尔比为1：(20～25)。
24、一些实施例中，所述聚半乳糖醛酸和gma的摩尔比为1：(20～24)。
25、一些实施例中，所述聚半乳糖醛酸和gma的摩尔比为1：(20～23)。
26、所述反应在惰性气体条件下进行；所述惰性气体优选为氮气；所述反应温度为60～80℃；反应时间为12～24h；
27、一些实施例中，所述反应温度为60～75℃；反应时间为12～20h；
28、一些实施例中，所述反应温度为60～70℃；反应时间为12～18h；
29、反应产物经沉淀、透析，冻干，即得pgama。所述沉淀具体为在无水乙醇中沉淀去除gma单体，沉淀在蒸馏水中透析，透析的天数为3天。
30、将pga-dmaps和pgama混合，滴加到接收液中，经配位偶联反应，制备得到微载体。
31、本发明所述配位偶联反应在微载体制备装置中进行，为本发明申请专利。。中所述。
32、本发明所述接收液为0.1m的cacl2溶液，加速电压8-10kv，25g针头；
33、按照本发明，所述pga-dmaps和pgama在水中的总浓度为6～10wt％；
34、一些实施例中，所述pga-dmaps和pgama在水中的总浓度为7～9wt％；
35、所述pga-dmaps和pgama的质量比为1:1～3:1，具体可以为1:1、1:2或1:3；或者上述任意二者之间的点值。
36、将所述微载体浸没在e7-cys溶液中，紫外灯照射，即得。
37、按照本发明，所述e7-cys溶液具体为使用0.05wt％的光引发剂2959溶液溶解e7-cys至0.5～1mg/ml；
38、一些实施例中，所述e7-cys溶液具体为使用0.05wt％的光引发剂2959溶液溶解e7-cys至0.6～1mg/ml；
39、一些实施例中，所述e7-cys溶液具体为使用0.05wt％的光引发剂2959溶液溶解e7-cys至0.7～1mg/ml；
40、本发明所述紫外灯照射具体为使用365nm，35w的紫外灯照射5～10min；优选为5～9min；更优选为5～8min。
41、本发明提供了一种具有骨髓间充质干细胞特异性粘附能力的聚半乳糖醛酸微载体，由上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到。
42、本发明采用了传统的聚半乳糖醛酸的制备方法，但在原始聚半乳糖醛酸的基础上进行了化学改性，附带了抗污能力，同时使用巯基和不饱和键的点击化学反应，最大程度地保护了生长因子的活性，最终制备的微载体对骨髓间充质干细胞具有特异的粘附能力。
43、与现有技术相比，本发明提供了一种具有骨髓间充质干细胞特异性粘附能力的聚半乳糖醛酸微载体的制备方法，包括如下步骤：a)聚半乳糖醛酸溶液、dmaps、aps和temed混合，在惰性气体保护下反应，反应产物经透析、冻干得到pga-dmaps；b)聚半乳糖醛酸溶液和gma在惰性气体保护下反应，反应产物经沉淀、透析，冻干，即得pgama；c)将pga-dmaps和pgama混合，滴加到接收液中，经配位偶联反应，制备得到微载体；d)将所述微载体浸没在e7-cys溶液中，紫外灯照射，即得。本发明通过自由基反应在聚半乳糖醛酸单体上先后接枝了[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵(dmaps)和甲基丙烯酸缩水甘油酯(gma)，并通过自有专利技术的高压静电制备装置以不同配比制作了细胞选择性微载体，传统的纯pga微载体不具备细胞选择性，而由pga-dmaps制备的微载体具备良好的抗细胞黏附能力，另外混合了pgama组分的pdma1，pdma2微载体同时具备了良好的抗非目的细胞黏附效果和骨髓间充质干细胞(bmsc)粘附能力，实现对细胞的特异选择能力。
1.一种具有骨髓间充质干细胞特异性粘附能力的聚半乳糖醛酸微载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a)所述聚半乳糖醛酸溶液的浓度为1～2wt％；所述溶液的ph值为8。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a)所述聚半乳糖醛酸的质量g、dmaps的质量g、aps的质量mg和temed的体积μl的比为(0.5～1.0)：(0.3～0.5)：(15～25)：(15～25)。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a)所述惰性气体为氮气；所述反应温度为25～35℃；反应时间为12～24h；所述透析在蒸馏水中透析，透析的天数为3天。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b)所述聚半乳糖醛酸溶液的浓度为1～2wt％；所述溶液的ph值为10。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b)所述聚半乳糖醛酸和gma的摩尔比为1：(20～25)。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b)所述惰性气体为氮气；所述反应温度为60～80℃；反应时间为12～24h；所述透析在蒸馏水中透析，透析的天数为3天；所述沉淀具体为在无水乙醇中沉淀。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤c)所述配位偶联反应在微载体制备装置中进行，所述接收液为0.1m的cacl2溶液，加速电压8-10kv，25g针头；
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤d)所述e7-cys溶液具体为使用0.05wt％的光引发剂2959溶液溶解e7-cys至0.5～1mg/ml；
10.一种具有骨髓间充质干细胞特异性粘附能力的聚半乳糖醛酸微载体，其特征在于，由权利要求1～9任意一项所述的制备方法制备得到。
