本发明属于分析检测，具体涉及一种检测nadh的聚集诱导发光点传感器及其制备方法和应用。
背景技术：
1、疾病通常伴随着代谢过程和生理环境的剧烈变化，并通过血液中相关代谢物的异常浓度体现。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型：nad+，还原型：nadh)是脱氢酶介导反应中一种极为重要的辅酶因子，在能量代谢和细胞功能调节中起着关键作用，nad+/nadh比例的改变与代谢性疾病和神经退行性疾病有关，包括肌少症、癌症、癫痫、帕金森病等。有效的nad+/nadh即时检测方法有利于相关疾病的早期诊疗，并推动与代谢物检测相关的医疗技术的发展。近年来，各种基于不同原理的检测方法如紫外分光光度法、电化学分析法、毛细管电泳法、色谱法、酶循环法等在nadh检测和推广应用上取得了进展，但仍然存在着许多缺点，比如检测过程复杂耗时、设备成本高、灵敏度和选择性低等。因此，开发用于快速、低成本、操作简便、灵敏的nadh检测的新材料及方法具有重要意义。
2、荧光检测方法可以通过内部荧光或外部探针获取生理信息，因其具备灵敏度高、响应速度快、无创、成本低等突出优点而备受关注，已成为生物传感和生物成像领域内应用最广泛的技术之一。除了荧光检测方法的设计原理外，检测中所使用的荧光团对荧光亮度、光稳定性、时间及空间分辨率也有很大影响，目前，已开发出许多用于生物医学的光学探针，包括量子点、碳点、上转换纳米粒子、半导体聚合物点、聚集诱导发光(aie)材料等。然而，许多传统光学探针都存在光漂白现象，这一现象会引发光化学损伤，使得荧光团无法持续发光，进而限制其持续时间和时间分辨率等性能，并使检测过程复杂化。此外，传统荧光团虽然在单分散状态下具有明亮的荧光发射，但在聚集状态下会发生荧光淬灭现象。这种由聚集引起的淬灭现象是传统发光材料另一个常见的不良因素，极大影响了受荧光团使用剂量限制的检测灵敏度和检测限。相比之下，聚集诱导发光(aie)材料在聚集态下具有强发射，并且其光漂白阈值高。aie材料在溶液或单分散状态下，活跃的分子内旋转和振动会加强非辐射弛豫，从而淬灭荧光；而在聚集状态下，受限的分子内运动会限制非辐射弛豫，使得更多分子经辐射跃迁途径返回基态，导致荧光的增强。因此，aie材料的使用可以摆脱使用剂量的限制，在高浓度下保持高的荧光强度和光稳定性。此外，带有特殊官能团的aie分子具有靶向能力，有利于提高选择性。这种机制使得aie材料能够广泛应用于多个生物医学领域，包括化学/生物传感、成像、治疗等。
3、在荧光检测领域，单个荧光发射强度很容易因背景和激发条件而改变，而比率荧光策略使用不止一种类型的荧光团对分析物做出响应，相比单色荧光策略能提供更稳定的检测精度。同时，比率荧光策略具有荧光检测的突出优点，包括灵敏、快速响应、非侵入性、低成本等，因而在代谢物poct(即时检验)中受到了广泛关注，目前还未有基于aie材料使用比率荧光策略检测nadh的方法报道。
技术实现思路
1、基于现有技术存在的不足，本发明旨在提供一种检测nadh的聚集诱导发光点传感器及其制备方法和应用。所述聚集诱导发光点传感器(aie点传感器)中的三苯胺(tpa)基团与nadh之间在紫外激发下发生电子转移，aie点传感器与nadh的发射荧光强度随nadh的浓度变化而变化，以此原理建立了对nadh浓度敏感的比率传感体系，针对nadh检测具有优异的性能。
2、本发明采用以下技术方案实现发明目的：
3、本发明的目的之一在于提供一种检测nadh的聚集诱导发光点传感器，所述聚集诱导发光点传感器包括tpa-bqd-py和两亲性聚合物。
4、所述tpa-bqd-py的结构式如式(ⅰ)所示：
5、
6、一般来说，电子传递系统由电子供体和受体组成，电子通过π共轭链(d-π-a结构)进行传输。nadh通常在电子代谢过程中发挥电子转运体的作用，能够与nadh构成典型d-π-a特性的传感器可以用于高灵敏和选择性的nadh传感。在本发明提供的聚集诱导发光点传感器中，tpa-bqd-py和两亲性聚合物均为现有技术制备的产品，tpa-bqd-py作为aie材料，其中的tpa基团由于其富电子、高摩尔吸收系数和高空穴传导特性而被用作紫外激发下的电子供体；两亲性聚合物包裹tpa-bqd-py聚集成为具有一定流体动力学直径的聚集体，并通过两亲性在水溶液中维持稳定性，即粒径稳定性。检测nadh时，所述聚集诱导发光点传感器常配制为水溶液使用，在紫外线激发下，带有tpa基团的aie点传感器吸收能量并完成电子的激发态跃迁。随后电子通过π共轭链从tpa基团传输到nadh，导致aie点传感器中形成空穴极化子，阻碍了辐射跃迁，从而引起aie点传感器的荧光猝灭。因此，nadh浓度的增加带来了荧光强度的巨大变化，aie点传感器的发射衰减(584nm)而nadh发射增强(470nm)。基于此原理，本发明提供的aie点传感器可与nadh建立一种比率型nadh生物传感体系，体系具有两个不同波长的荧光(584nm、470nm)，在nadh检测上具有高灵敏度、准确性和选择性。
7、进一步地，所述聚集诱导发光点传感器的平均流体动力学直径为40～60nm；优选地，所述聚集诱导发光点传感器的平均流体动力学直径为42～50nm。
8、进一步地，所述两亲性聚合物为peg-b-ppg-b-peg、ps-peg-cooh、peg-b-phep、silane-peg-azide、silane-peg、dspe-peg、dspe-peg-nh2、苯乙烯-马来酸酐共聚物中的一种或多种，优选为苯乙烯-马来酸酐共聚物；所述苯乙烯-马来酸酐共聚物的数均分子量mn为1500～2500，优选为1800～1900。
9、所述苯乙烯-马来酸酐共聚物的结构式如式(ⅱ)所示：
10、
11、进一步地，所述tpa-bqd-py和苯乙烯-马来酸酐共聚物的质量比为1:3～4:1，优选为1:2～1:1，更优选地，为1:2。
12、本发明的目的之二在于提供tpa-bqd-py在制备检测nadh的聚集诱导发光点传感器中的应用。
13、本发明的目的之三在于提供一种制备上述聚集诱导发光点传感器的制备方法，包括如下步骤：
14、s1，将tpa-bqd-py和两亲性聚合物溶解于有机溶剂中，使用有机溶剂稀释得到混合溶液a；其中，所述混合溶液a中tpa-bqd-py的浓度为0.1～0.3mg/ml；
15、s2，将混合溶液a在超声条件下注入超纯水中，获得混合溶液b；去除混合溶液b中的有机溶剂，过滤，得到含有所述聚集诱导发光点传感器的溶液；
16、s3，将含有所述聚集诱导发光点传感器的溶液冷冻干燥，得到所述聚集诱导发光点传感器。
17、进一步地，步骤s1中，所述有机溶剂为四氢呋喃；所述混合溶液a中tpa-bqd-py的浓度为0.2mg/ml。
18、进一步地，步骤s2中，所述混合溶液a与超纯水的体积比为1:2～8；所述超声频率为40khz，超声时间为1～2min。
19、在本发明的一个实施例中，步骤s2中，所述混合溶液a与超纯水的体积比为1:8。
20、进一步地，所述去除混合溶液b中的有机溶剂为对混合溶液b加热并持续通入惰性气体，直至将溶液中的有机溶剂去除；所述加热条件为85℃～95℃，加热时间为0.5～1h；所述惰性气体为氮气，通入时间为0.5～1h。
21、在本发明的一个实施例中，所述加热条件为90℃，加热时间为0.5h，使用加热型磁力搅拌器完成加热。
22、进一步地，所述过滤为通过0.4～0.5μm滤膜过滤，以滤除溶液中的杂质或者过大的聚集体颗粒。
23、优选地，所述过滤为通过0.45μm滤膜过滤。
24、本发明的目的之四在于提供上述聚集诱导发光点传感器和/或利用如上述制备方法制备的聚集诱导发光点传感器在检测nadh中的应用。
25、进一步地，所述检测nadh包括体外检测nadh、体内检测nadh中的一种或两种。
26、本发明的目的之五在于提供上述聚集诱导发光点传感器和/或利用如上述制备方法制备的聚集诱导发光点传感器在制备nadh即时检测产品中的应用。
27、本发明的目的之六在于提供一种nadh即时检测产品，所述产品包括上述聚集诱导发光点传感器；和/或利用如上述制备方法制备的聚集诱导发光点传感器。
28、本发明提供的aie点传感器可用于nadh的浓度检测。该检测基于aie点传感器和nadh之间的电子转移实现，aie点传感器(发射峰584nm)和nadh(发射峰470nm)构成了比率荧光体系，随着nadh浓度升高，aie点传感器的荧光强度因猝灭下降，nadh的荧光强度升高。在一定范围内，二者的发射峰荧光强度比值(即r/r0，r＝i470/i584，r0为nadh浓度为0时的r值)与nadh的浓度存在相关性。且aie点传感器无细胞毒性，可被细胞内吞，经实验验证发现aie点传感器可以结合智能移动设备实现体内/外nadh成像，能更快速、方便、低成本的方式实现对nadh的浓度检测，即nadh poct(point-of-care testing，即时检测)。
29、与现有技术相比，本发明提出的一种检测nadh的聚集诱导发光点传感器及其制备方法和应用，具有以下有益效果：
30、(1)本发明提供的制备聚集诱导发光点传感器的方法步骤简单，原料易得，可大规模生产和应用。
31、(2)本发明提供的聚集诱导发光点传感器可建立对nadh浓度敏感的比率传感体系，针对nadh检测具有优异的灵敏度、选择性、光稳定性、可逆性、快速响应能力和超低的检测限(110nm)。
32、(3)本发明提供的聚集诱导发光点传感器可建立基于智能手机的nadh比率传感系统，应用于nadh的体内/外成像，通过智能手机和数码相机获取aie点传感器的rgb图像，并计算蓝色通道和红色通道强度的比值，从而实现准确、快速、方便、低成本的nadh即时检测。
33、(4)本发明提供的聚集诱导发光点传感器可用于制备nadh即时检测产品，并广泛地用于活体中nadh水平的检测。
34、说明书附图
35、图1为本发明一种检测nadh的聚集诱导发光点传感器的原理示意图。
36、图2为一个实施例中tpa-bqd-py aie的(a)1h和(b)13c核磁共振波谱图。
37、图3为一个实施例中制备的aie点传感器的tem图像(a)、流体动力学直径图(b)、16天内流体动力学直径分布图(c)以及吸收和发射光谱图(d)。
38、图4为一个实施例中与不同浓度的nadh混合后aie点传感器的荧光光谱图和关系曲线图；其中(a)为含有0至300μm范围内nadh的aie点传感器溶液(10μg/ml)在365nm激发下的发射光谱；(b)为含有300至5000μm范围内nadh的aie点传感器溶液(10μg/ml)的发射光谱；(c)为aie点传感器荧光响应的比例曲线；(d)为aie点传感器的斯特恩-沃尔默曲线。
39、图5为一个实施例中aie点传感器溶液(10μg/ml)在持续30分钟365nm的激发下584nm处的荧光强度变化图。
40、图6为一个实施例中在含有1000μm nadh的aie点传感器溶液的荧光响应图(a)以及在持续30分钟365nm的激发下荧光比率变化图。
41、图7为一个实施例中将aie点传感器反复暴露于0和200μm nadh的溶液环境中的荧光比率变化图。
42、图8为一个实施例中aie点传感器在nadh和其他六种分析物环境中的荧光光谱图(a)和荧光比率图(b)。
43、图9为一个实施例中aie点传感器在含有0～10μm fad环境中的荧光光谱图。
44、图10为不同质量比的aie点传感器与不同浓度(0～5000μm)的nadh混合后aie点传感器的荧光光谱图。
45、图11为使用不同浓度aie点传感器孵育24小时后的hepa 1-6和alpha tn4-1细胞活性。
46、图12为一个实施例中经aie点传感器培育24小时后不添加/添加nadh(最终浓度300μm)的alpha tn4-1细胞图像；其中，图(a-c)为不添加nadh的alpha tn4-1细胞的(a)明场图像、(b)荧光图像以及(c)三维荧光强度图；图(d-f)为添加nadh(最终浓度300μm)的alpha tn4-1细胞的(d)明场图像、(e)荧光图像以及(f)三维荧光强度图。
47、图13为一个实施例中，紫外激发下aie传感器在不同nadh浓度(0～300μm)环境下的真彩色图像(a)、伪彩色图像(b)以及荧光图像的a/a0比例曲线(c)。
48、图14为一个实施例中，在365nm紫外灯下，用智能手机拍摄的仅含有nadh(0-300μm)的荧光图像(a)及对应荧光图像的b/b0比率值。
49、图15为一个实施例中使用智能手机进行体内nadh成像的原理示意图。
50、图16为一个实施例中使用智能手机/数码相机拍摄的注射了含不同浓度nadh(0、50、100和200μm)的aie点传感器溶液的裸鼠背侧四个不同部位皮下在正常光照和紫外激发下的照片及对应的荧光图像的a/a0比例曲线；其中(a、b)为智能手机拍摄组，(c、d)为数码相机拍摄组。
51、上图中：r为470nm与584nm处的荧光强度比值(i470/i584)；r0为不存在nadh时的r值；i则表示在nadh不同浓度下的荧光强度；i0表示nadh不存在时aie点传感器在584nm处的荧光强度；a为蓝色与红色通道强度(像素阵列数据)之比；a0表示在没有nadh时的a值；b为蓝色通道强度；b0为在没有nadh的情况下的b值。
1.一种检测nadh的聚集诱导发光点传感器，其特征在于，所述聚集诱导发光点传感器包括tpa-bqd-py和两亲性聚合物。
2.根据权利要求1所述的聚集诱导发光点传感器，其特征在于，所述聚集诱导发光点传感器的平均流体动力学直径为40~60 nm，优选为42~50 nm。
3.根据权利要求1所述的聚集诱导发光点传感器，其特征在于，所述两亲性聚合物为peg-b-ppg-b-peg、ps-peg-cooh、peg-b-phep、silane-peg-azide、silane-peg、dspe-peg、dspe-peg-nh2、苯乙烯-马来酸酐共聚物中的一种或多种，优选为苯乙烯-马来酸酐共聚物；所述苯乙烯-马来酸酐共聚物的数均分子量mn为1500~2500，优选为1800~1900；
4.tpa-bqd-py在制备检测nadh的聚集诱导发光点传感器中的应用。
5.一种制备权利要求1-3任一项所述的聚集诱导发光点传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述有机溶剂为四氢呋喃；所述混合溶液a中tpa-bqd-py的浓度为0.2 mg/ml。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中，所述混合溶液a与超纯水的体积比为1:2~8；所述超声频率为40 khz，超声时间为1~2 min；
8.如权利要求1-3任一项所述的聚集诱导发光点传感器和/或利用如权利要求5-7任一项所述的制备方法制备的聚集诱导发光点传感器在检测nadh中的应用，其特征在于，所述应用包括体外检测nadh、体内检测nadh中的一种或两种。
9.如权利要求1-3任一项所述的聚集诱导发光点传感器和/或利用如权利要求5-7任一项所述的制备方法制备的聚集诱导发光点传感器在制备nadh即时检测产品中的应用。
10.一种nadh即时检测产品，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的聚集诱导发光点传感器，和/或利用如权利要求5-7任一项所述的制备方法制备的聚集诱导发光点传感器。
