本发明涉及干扰素制剂，尤其涉及一种重组猪α+γ干扰素融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术：
1、干扰素(interferon，ifn)是一组具有多种功能的糖蛋白，是由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子，具有广谱的抗病毒作用，其并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制。猪α干扰素(poifnα)与猪γ干扰素(poifnγ)均为绿色高效、可替代抗生素的新型生物兽药。猪α干扰素属于i型干扰素，主要由白细胞产生，具有抗病毒的作用；猪γ干扰素属于ii型干扰素，主要由t细胞和nk细胞产生，具有免疫应答调节、抗增殖活性的作用，抗病毒活性稍弱。
2、一般情况下，动物体内干扰素基因常处于封闭状态，只有在病毒等因素的诱导下才能表达，并且表达量极微，难以直接从动物体内直接提取天然干扰素。因此，在考虑用于扰素防治畜禽疾病时，只有给予外源性干扰素才能达到较好效果，而利用基因工程技术研制和开发重组干扰素是一条高效而经济的途径。自1986年首次克隆出猪干扰素基因以来，迄今已有多种猪干扰素基因被克隆、表达和生物学功能研究。但是重组表达的单体干扰素抗病毒活性不高，无法兼具抗病毒与免疫调节的作用。此外，由于重组干扰素在使用过程中会出现体内代谢降解、半衰期较短等问题，所以限制了其在临床上的应用。我国是一个养猪大国，但目前有多种传染病严重危害着我国养猪业的发展，因此，目前急需研制出安全、高效、新型的抗病毒及免疫增强剂用于增强猪的抗病毒能力，并提高现有疫苗的保护率。
技术实现思路
1、针对上述问题，本发明提供一种重组猪α+γ干扰素融合蛋白及其制备方法和应用，本发明提供的重组猪α+γ干扰素融合蛋白，具有良好的生物活性和较低的细胞毒性，同时具有较高的抗病毒性和调节免疫的功能，可有效提高猪的抗病毒能力。
2、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
3、第一方面，本发明提供一种重组猪α+γ干扰素融合蛋白，所述重组猪α+γ干扰素融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示，包括重组猪α干扰素、柔性连接体和重组猪γ干扰素，所述重组猪α干扰素和所述重组猪γ干扰素通过所述柔性连接体相连接。
4、优选的，所述重组猪α干扰素的氨基酸序列如seq id no:2所示。
5、优选的，所述重组猪γ干扰素的氨基酸序列如seq id no:3所示。
6、优选的，所述柔性连接体的氨基酸序列为ggggsggggsggggs。
7、相对于现有技术，本发明提供的重组猪α+γ干扰素融合蛋白，将猪α干扰素与猪γ干扰素联合使用，可以高效抵抗病毒感染，同时增强免疫能力，即具有抗病毒和免疫调节的双重作用，大大提高了干扰素的抗病毒活性。
8、第二方面，本发明提供一种编码上述重组猪α+γ干扰素融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no:4所示，包括猪α干扰素基因、柔性连接体基因和猪γ干扰素基因，所述猪α干扰素基因和所述猪γ干扰素基因通过所述柔性连接体基因相连接。
9、优选的，所述猪α干扰素基因的核苷酸序列如seq id no:5所示。
10、优选的，所述猪γ干扰素基因的核苷酸序列如seq id no:6所示。
11、优选的，所述柔性连接体基因的核苷酸序列如seq id no:7所示。
12、优选的，所述猪α干扰素基因的制备方法包括：去除原猪α干扰素基因的信号肽序列，根据大肠杆菌对密码子的偏爱性进行筛选，得猪α干扰素基因。
13、优选的，所述猪γ干扰素基因的制备方法包括：去除原猪γ干扰素基因的信号肽序列，根据大肠杆菌对密码子的偏爱性进行筛选，得猪γ干扰素基因。
14、本发明通过去除原干扰素基因中的信号肽序列，避免对后续蛋白的可溶性表达产生不利影响；通过对原干扰素的基因序列进行筛选，能够提高其mrna二级结构的稳定性，避免因为不充足的trna库导致翻译延迟、成熟前翻译终止、翻译移码和氨基酸错配，提高了转录和翻译的效率，有利于提高后续蛋白的产量。
15、进一步优选的，所述原猪α干扰素基因为在genbank(美国国家生物技术信息中心)中注册的猪α干扰素的编码序列，登录号为kf414740.1。
16、进一步优选的，所述原猪γ干扰素基因为在genbank中注册的猪γ干扰素的编码序列，登录号为nm213948.1。
17、需要说明的是，本发明对去除信号肽序列的方式、筛选基因序列的方式及基因连接的方式不作要求，采用本领域常规操作即可。
18、第三方面，本发明提供一种包含上述基因的重组表达载体，所述重组表达载体选自pet-28a载体。
19、第四方面，本发明提供一种上述重组表达载体的制备方法，包括如下步骤：
20、分别采用ecorⅰ和xhoⅰ对pet-28a载体进行双酶切，通过同源重组的方式将上述基因连接到所述pet-28a载体上，得重组表达载体。
21、本发明提供的重组表达载体的制备方法，将基因序列优化后的猪α干扰素基因与猪γ干扰素基因通过特定的柔性连接体基因进行串联融合表达，并克隆到pet-28a载体上，特定的大肠杆菌表达载体减少了表达蛋白对细胞的毒性作用，有利于后续在大肠杆菌宿主细胞中得到表达和纯化。
22、示例的，进行双酶切后，需要去掉pet-28a载体上被ecorⅰ和xhoⅰ切掉的中间那一小段的基因序列，再通过同源重组的方式将重组猪α+γ干扰素连接到剩余的pet-28a载体上。
23、优选的，得到重组表达载体后，还包括：将所述重组表达载体转移到dh5α感受态中进行增殖。
24、进一步优选的，所述重组表达载体和所述dh5α感受态的体积比为1:(45～55)。
25、第五方面，本发明提供一种基因工程菌，包含上述重组表达载体和大肠杆菌宿主细胞。
26、优选的，所述大肠杆菌宿主细胞为bl21(de3)。
27、第六方面，本发明提供一种上述重组猪α+γ干扰素融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：
28、s1，将上述重组表达载体转移到大肠杆菌宿主细胞中，得基因工程菌；
29、s2，采用iptg对所述基因工程菌进行诱导表达，得融合蛋白粗品；
30、s3，对所述融合蛋白粗品进行纯化和复性，得重组猪α+γ干扰素融合蛋白。
31、本发明提供的重组猪α+γ干扰素融合蛋白的制备方法，操作简便易行，重现性好，外源蛋白的表达量大、毒性小且活性高，为增强猪的抗病毒能力和免疫调节能力提供了更好的保障。
32、优选的，包括如下步骤：
33、s1，将所述重组表达载体转移到bl21(de3)中，加入lb液体培养基中进行活化，将所得体系涂抹到卡那霉素lb固体培养基上，进行生长，得基因工程菌；
34、s2，选取所述基因工程菌的单个阳性菌落在卡那霉素lb液体培养基上进行培养，当菌落的od600＝0.6～0.8时，加入iptg进行诱导表达，离心，得菌泥；将所述菌泥用pbs缓冲液重悬，超声裂解，离心，得融合蛋白粗品；
35、s3，将所述融合蛋白粗品与结合缓冲液混合均匀，得蛋白溶液；将所述蛋白溶液过镍-琼脂糖凝胶树脂柱，用包涵体洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱蛋白溶液；
36、将所述洗脱蛋白溶液放入透析袋中，将所述透析袋放入复性液中进行复性，得重组猪α+γ干扰素融合蛋白。
37、本发明中，iptg为异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，结合缓冲液为binding buffer，包涵体洗脱缓冲液为inclusion body elution buffer。
38、本发明提供的重组猪α+γ干扰素融合蛋白的制备方法，将所得重组表达载体转移到大肠杆菌表达菌株bl21(de3)上，提高了表达外源蛋白的效率和稳定性；然后筛选出对卡那霉素具有抗性的阳性菌落(基因工程菌)，用iptg成功诱导其表达干扰素蛋白，得到大量表达外源蛋白；最后用his标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白，复性后得到高纯度且同时具有优异的抗病毒性能和免疫调节功能的重组猪α+γ干扰素融合蛋白。
39、优选的，所述重组质粒、所述bl21(de3)和所述lb液体培养基的体积比为1:(45～55):(450～550)。
40、示例的，所述体系和所述卡那霉素lb固体培养基的体积比为1:(130～170)。
41、示例的，lb固体培养基中含有酵母提取物5g/l、胰蛋白胨10g/l、nacl 10g/l和琼脂粉15g/l。
42、优选的，所述生长的条件包括：温度为35～37℃，湿度为60％～70％，生长时间为10～16h。
43、示例的，lb液体培养基中含有酵母提取物5g/l、胰蛋白胨10g/l和nacl 10g/l。
44、优选的，所述单个阳性菌落、所述卡那霉素lb液体培养基和所述pbs缓冲液的体积比为(0.8～1.2):100:(4～6)。
45、优选的，所述培养的条件包括：温度为35～37℃，摇床速度为180～220rpm。
46、优选的，所述iptg的终浓度为0.8～1.2mmol/l。
47、优选的，所述诱导表达的条件包括：温度为35～37℃，摇床速度为180～220rpm，诱导时间为4～6h。
48、示例的，所述离心的温度均为2～10℃，转速均为9000～12000rpm，离心时间均为10～12min。
49、示例的，超声功率为30％，超声2s，停2s，超声时间为10～20min。
50、优选的，所述结合缓冲液是所述卡那霉素lb液体培养基体积的4％～6％。
51、优选的，所述镍-琼脂糖凝胶树脂柱的粒径为45～165μm，配基含量为10～15μmol。
52、本发明通过将蛋白溶液过镍-琼脂糖凝胶树脂柱，可以有效分离纯化带his标签的重组蛋白。本发明对过柱子的方法不做限定，采用本领域常规做法即可，可以参照镍-琼脂糖凝胶树脂柱的说明书进行操作。
53、优选的，所述洗脱蛋白溶液的浓度为0.6～1.0mg/ml。
54、优选的，将所述洗脱蛋白溶液放入所述透析袋之前，还包括：采用复性液进行稀释，至洗脱蛋白溶液的浓度为0.1～0.5mg/ml。
55、本发明通过调整洗脱蛋白溶液的浓度，可以进一步提高复性效果。
56、示例的，10ml所述复性液中含有8.71g精氨酸、0.0612g氧化型谷胱甘肽和0.09g还原型谷胱甘肽。
57、优选的，所述复性的温度为2～6℃，复性时间为24～30h，每6～8h更换一次所述复性液。
58、本发明通过限定复性的条件，可以有效防止蛋白降解，同时可以增加蛋白的活性，增强蛋白的功能性。本发明对复性液的用量不作限定，可以浸没透析袋即可。
59、示例的，所述复性之后，还包括将复性后的洗脱蛋白溶液用0.22μm滤膜过滤，以去除细菌，保证蛋白不被细菌污染。
60、第七方面，本发明提供一种上述重组猪α+γ干扰素融合蛋白在制备抗病毒药物中的应用。
61、第八方面，本发明提供一种缓释药物，包括有效组分和载体，所述有效组分为上述重组猪α+γ干扰素融合蛋白，所述载体为水凝胶。
62、本发明将重组猪α+γ干扰素融合蛋白用于缓释药物，水凝胶具有良好的空间网络结构和热稳定性，为有效组分的储存和释放提供了强有力的支持，可以实现重组猪α+γ干扰素融合蛋白在体内的缓慢释放，延长干扰素在体内的半衰期，有助于长效干扰素的研究以及抗病毒防治。
63、优选的，所述载体与所述有效组分的质量体积比为1g：(18～22)ml。
64、优选的，所述水凝胶为ph敏感性水凝胶。
65、进一步优选的，所述ph敏感性水凝胶包括以下重量份数的原料：明胶100份、腐殖酸钾9～11份、丙烯酰胺55～65份、2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸18～22份、过硫酸钾13～15份和n,n'-亚甲基双丙烯酰胺7～9份。
66、更优选的，所述ph敏感性水凝胶的制备方法包括以下步骤：
67、sa，按照设计配比称取各原料，将明胶和腐殖酸钾溶于水中，混合均匀，得第一混合溶液；
68、sb，将丙烯酰胺、2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸、过硫酸钾和n,n'-亚甲基双丙烯酰胺溶于水中，混合均匀，得第二混合溶液；
69、sc，将所述第一混合溶液与所述第二混合溶液混合均匀，于55～65℃反应3～4h，得ph敏感性水凝胶。
70、需要说明的是，步骤sa和sb没有先后顺序。步骤sc中反应结束后，还需要进行过滤，洗涤，切块，冷冻干燥，研磨。
71、优选的，所述ph敏感性水凝胶的粒径为100～200μm。
72、第九方面，本发明提供上述缓释药物的制备方法，包括以下步骤：
73、将水凝胶浸渍于重组猪α+γ干扰素融合蛋白中，得缓释药物。
74、优选的，所述浸渍的时间为12～24h。
75、示例的，所述水凝胶与所述重组猪α+γ干扰素融合蛋白的质量体积比为1g：(18～25)ml。
1.一种重组猪α+γ干扰素融合蛋白，其特征在于，所述重组猪α+γ干扰素融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示，包括重组猪α干扰素、柔性连接体和重组猪γ干扰素，所述重组猪α干扰素和所述重组猪γ干扰素通过所述柔性连接体相连接。
2.一种编码权利要求1所述的重组猪α+γ干扰素融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no:4所示，包括猪α干扰素基因、柔性连接体基因和猪γ干扰素基因，所述猪α干扰素基因和所述猪γ干扰素基因通过所述柔性连接体基因相连接。
3.一种包含权利要求2所述的基因的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体选自pet-28a载体。
4.一种权利要求3所述的重组表达载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.一种基因工程菌，其特征在于，包含权利要求3所述的重组表达载体和大肠杆菌宿主细胞。
6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌宿主细胞为bl21(de3)。
7.一种权利要求1所述的重组猪α+γ干扰素融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.一种权利要求1所述的重组猪α+γ干扰素融合蛋白在制备抗病毒药物中的应用。
9.一种缓释药物，其特征在于，包括有效组分和载体，所述有效组分为权利要求1所述的重组猪α+γ干扰素融合蛋白，所述载体为水凝胶。
10.如权利要求9所述的缓释药物，其特征在于，所述载体与所述有效组分的质量体积比为1g：(18～22)ml。
