本发明属于细胞免疫治疗，具体涉及一种利用crispr/cas9基因编辑技术对car-t细胞的tigit基因进行敲除的方法和应用。
背景技术：
1、嵌合抗原受体t细胞（chimeric antigen receptor t cell, car-t）是一种是使用基因工程技术对t细胞进行改造的疗法，该疗法通过将抗体的抗原结合区域即单链抗体可变区（single-chain fragment variable, scfv）与t细胞受体进行融合，形成嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, car），进一步通过病毒载体等方法将car基因转入t细胞制备形成car-t细胞。car-t细胞通过其scfv结构特异性识别肿瘤抗原，在car-t细胞的胞内外不同结构域的共同作用下，在识别特定抗原后可越过mhc的提呈机制而直接被激活，对肿瘤细胞发挥强烈的杀伤作用。
2、近年来， car-t细胞疗法作为一种创新性的癌症治疗手段，已在临床上取得显著成功。然而，其长期疗效受到t细胞抑制分子的负面调控，其中tigit作为一种关键的抑制因子，严重制约了car-t细胞的抗肿瘤活性。主要原因是：1. 耗竭问题： car-t细胞在抗肿瘤治疗中常常会面临由于长时间的活化而导致的耗竭问题，这限制了细胞的生存能力和持久性。tigit作为一个负调控因子，加剧了car-t细胞的疲惫程度。2. 持久性问题：当前car-t细胞在体内的存在时间有限，这限制了其对肿瘤的持久性攻击。tigit的存在加速了car-t细胞的失活，减少了其在体内的寿命，因此，需要找到一种方法来延长car-t细胞的功能性存在时间，使其能够更持久地发挥抗肿瘤作用。
3、免疫检查点是人体免疫系统中的重要调控通路，被称为免疫系统的“刹车”，可抑制t细胞功能。在现有的car-t治疗的基础上联合应用抑制免疫检查点（例如pd-1、ctla-4和lag-3）的治疗可以提高car-t细胞的杀伤效果。
4、目前已有在car-t治疗基础上联合进行pd-1靶向治疗/基因编辑的技术，技术实现形式有car-t治疗联合pd-1单克隆抗体、对car-t进行基因编辑使其能够额外分泌pd-1抗体、对car-t进行基因编辑敲除pd-1基因等，并已有充分研究显示其具有显著疗效，证实了car-t治疗基础上联合免疫检查点治疗的可行性。但目前并无关于tigit基因编辑的car-t细胞治疗的技术。crispr/cas9技术具有基因敲除效率高、简便易行、普适性强等优点，为改善car-t细胞功能提供了一种可行的策略。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的是提供一种利用crispr/cas9基因编辑技术对car-t细胞的tigit基因进行敲除的方法和应用。本发明利用crispr/cas9基因编辑技术对car-t细胞的tigit进行敲除，设计出tigit敲除的car-t细胞（简称为△tigit-car-t），该car-t细胞由于不表达tigit而避免受肿瘤微环境中tigit配体诱导的t细胞免疫抑制，因而能够维持car-t细胞持久的抗肿瘤活性。
2、为实现上述目的，本发明提供了特异性靶向car-t细胞的tigit的sgrna，所述sgrna的核苷酸序列seqidno.1所示。其是针对靶基因homo sapiens t cellimmunoreceptor with ig and itim domains (tigit) （nm_173799.4），使用chopchop网站（http://chopchop.cbu.uib.no/）设计小向导rna（small guide rna, sgrna），设计出的。
3、相应地，本发明提供了一种利用crispr/cas9基因编辑技术对car-t细胞的tigit基因进行敲除的方法，包括如下步骤：
4、（1）将权利要求1所述的sgrna和cas9蛋白混匀、孵育，得到sgrna- cas9蛋白复合物；
5、（2）取car-t细胞，用电转液配制成car-t细胞悬液；
6、（3）将car-t细胞悬液与sgrna- cas9蛋白复合物混匀，进行电击转染，完成后，将细胞转移至培养基中进行培养。
7、进一步地，步骤（2）电击转染的条件是：570 v、20 ms。
8、进一步地，所述sgrna和cas9蛋白的质量比为：5:1。
9、进一步地，步骤（1）孵育时间为15 min。
10、进一步地，步骤（3）转移至培养基中培养，培养密度为2×106/ml，离心换液后，调整培养密度为1×106/ml。
11、相应地，本发明还提供了一种 △tigit-car-t细胞，由上述的方法制备而得。
12、进一步地，本发明还提供了上述△tigit-car-t细胞在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的应用，或在预防或治疗肿瘤中的应用。
13、本发明的有益效果是：
14、使用本发明的方法对tigit基因敲除，使car-t细胞的增殖能力增强、耗竭减少，提高了其在体内的生存能力，使car-t细胞能够在体内发挥更持久的作用。并且，实验证明，tigit基因敲除的car-t细胞在小鼠体内对肿瘤细胞的杀伤作用更强，增强了car-t治疗效果。
15、本发明提供了一种通过crispr/cas9基因编辑技术对car-t细胞的tigit基因进行敲除的创新方法，为提高car-t细胞在抗肿瘤治疗中的持久性和效果提供了新的途径，该技术具有广阔的应用前景，有望在癌症治疗领域产生显著的临床价值。
1.特异性靶向car-t细胞的tigit的sgrna，其特征在于，所述sgrna的核苷酸序列seqidno.1所示。
2.一种利用crispr/cas9基因编辑技术对car-t细胞的tigit基因进行敲除的方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）电击转染的条件是：570 v、20 ms。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述sgrna和cas9蛋白的质量比为：5:1。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）孵育时间为15 min。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3）转移至培养基中培养，培养密度为2×106/ml，离心换液后，调整培养密度为1×106/ml。
7.一种 △tigit-car-t细胞，其特征在于，由权利要求2-6任意一种所述的方法制备而得。
8.根据权利要求7所述的△tigit-car-t细胞在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的应用，或在预防或治疗肿瘤中的应用。
