本发明属于生物，更具体地，本发明涉及腺苷脱氨酶、碱基编辑器融合蛋白、碱基编辑器系统及用途。
背景技术：
1、如何精准、高效地对基因组进行修饰是生命科学领域研究的重要目标，而crispr(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/cas9介导的基因编辑技术成为实现该目标的最强工具。传统的crispr/cas9技术通过在靶点处产生dna双链断裂(double strand breaks,dsb)，从而诱发细胞内的同源重组(homologousrecombination,hr)和非同源末端连接(non-homologous end joining,nhej)修复途径，进而实现对基因组dna的定点敲除、替换、插入等修饰。然而，dsb引发的dna修复很难实现高效稳定的单碱基突变。
2、单核苷酸变异会导致大约2/3人类遗传病的发生，也是许多动植物重要性状变异的遗传基础，因此开发一种精准且能够高效实现单碱基替换的技术尤为重要，david r.liu实验室开发的碱基编辑器就是为此而生的。david r.liu实验室开发了三种不同的碱基编辑器，分别是胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor,cbe)、腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor,abe)和先导编辑器(prime editor)，这些碱基编辑器在工作时不依赖dsb的产生，也不需要供体dna的参与。
3、以腺苷脱氨酶为基础的腺嘌呤碱基编辑技术主要是利用由切口酶cas9n(d10a)或dcas9结合腺苷脱氨酶组成融合蛋白，在sgrna的引导下，将位于碱基编辑活性窗口内的靶碱基腺嘌呤a脱氨形成次黄嘌呤i，再经dna修复和复制后逐渐被替换为g，最终形成a向g的定向替换(a至g)。
4、但是目前的碱基编辑器存在位点依赖性的编辑效率的差异，并且编辑窗口较宽导致非必要的编辑，因此对现有碱基编辑器的改造十分必要。
技术实现思路
1、发明要解决的问题
2、本发明的目的在于克服上述缺点，提供了一种新的腺苷脱氨酶，以及包含该腺苷脱氨酶的碱基编辑器融合蛋白、碱基编辑器系统，以提高a·t到g·c的编辑效率并提高碱基编辑的精确性(缩小编辑窗口)。
3、用于解决问题的方案
4、在本发明的一些方面，提供了一种腺苷脱氨酶，其包含以下序列中的一种或多种：
5、(i)如seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列；
6、(ii)与seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列具有至少80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且其保留如seq idno:1或seq id no:2所示的氨基酸序列的脱氨活性；
7、(iii)在seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并且其保留如seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列的脱氨活性；或者，
8、(iv)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码如seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，并且所述氨基酸序列保留如seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列的脱氨活性，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。
9、在一些实施方案中，所述的取代为在如seq id no:1所示的氨基酸序列的以下位点中的一个或多个发生的取代：
10、s15、d16、h17、f19、n20、d21、e22、y23、w24、r26、h27、l29、k33、r34、a35、v41、v43、l47、l49、n59、a61、i62、a69、e72、g80、l81、v82、l83、q84、n85、y86、i89、d90、a91、t92、v95、f97、i112、s113、r114、l115、f117、v119、r120、n121、k123、r124、n132、v133、l134、n135、p137、g138和m139。
11、在另一些实施方案中，所述的取代为在如seq id no:2所示的氨基酸序列的以下位点中的一个或多个发生的取代：
12、k19、a20、r21、e22、v33、l34、d35、d36、a46、i47、t48、l49、v80、t81、f82、e83、p84、i97、k98、r99、g103、v104、s105、n106、s107、k108、r109、g110、l116、n117、v118、l119、n120、y121、p122、g123、c144、q145、f146、y147、q148、q149、p150、r151、e152、v153、f154、n155。
13、在一些具体的实施方案中，所述的取代为在如seq id no:1所示的氨基酸序列的以下位点中的一个或多个发生的取代：s15t、d16e、h17k、f19y、n20q、e22d、y23f、w24f、r26k、h27r、l29i、k33r、r34k、a35s、g80a、l81n、v82a、l83i、q84n、n85s、y86w、i89l、d90g、a91t、t92d、i112l、s113k、r114k、n132k、v133i、l134f、n135h、p137f、g138a和m139l。
14、在一些更具体的实施方案中，所述的取代为在如seq id no:1所示的氨基酸序列的以下位点的组合发生的取代：
15、(1)s15t、d16e、h17k、f19y、n20q；
16、(2)e22d、y23f、w24f、r26k、h27r、l29i；
17、(3)k33r、r34k、a35s；
18、(4)g80a、l81n、v82a、l83i、q84n、n85s、y86w；
19、(5)i89l、d90g、a91t、t92d；
20、(6)i112l、s113k、r114k；
21、(7)n132k、v133i、l134f、n135h；和/或
22、(8)p137f、g138a、m139l。
23、在本发明的一些方面，提供了一种碱基编辑器融合蛋白，其包含上述的腺苷脱氨酶，以及核酸可编程核苷酸结合结构域。
24、在一些实施方案中，所述核酸可编程核苷酸结合结构域为cas蛋白或ago蛋白。
25、在一些实施方案中，所述碱基编辑器融合蛋白中还包括至少一条核定位信号序列。
26、在一些可选的实施方案中，所述碱基编辑器融合蛋白中还包括接头。在一些任选的实施方案中，所述接头包含如seq id no:3～12所示的序列中的一种或多种。
27、在一些具体的实施方案中，所述碱基编辑器融合蛋白包含以下序列中的一种或多种：
28、(i)如seq id no:22或seq id no:23所示的氨基酸序列；
29、(ii)与seq id no:22或seq id no:23所示的氨基酸序列具有至少80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且其保留如seq id no:22或seq id no:23所示的氨基酸序列的结合多核苷酸和碱基编辑活性；
30、(iii)在seq id no:22或seq id no:23所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并且其保留如seq id no:22或seq id no:23所示的氨基酸序列的结合多核苷酸和碱基编辑活性；或者，
31、(iv)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码如seq id no:22或seq id no:23所示的氨基酸序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，并且所述氨基酸序列保留如seq id no:22或seq id no:23所示的氨基酸序列的结合多核苷酸和碱基编辑活性，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。
32、在一些更具体的实施方案中，所述的碱基编辑器融合蛋白包含seq id no:46～53所示序列中的任一种。
33、在本发明的一些方面，提供了一种多核苷酸，其编码上述的腺苷脱氨酶或者编码上述的碱基编辑器融合蛋白。
34、在本发明的一些方面，提供了一种载体，其包含上述的多核苷酸。
35、在本发明的一些方面，提供了一种细胞，其包含上述的腺苷脱氨酶、上述的碱基编辑器融合蛋白、上述的多核苷酸和上述的载体中的一种或多种。
36、在本发明的一些方面，提供了一种碱基编辑器系统，其包含上述的腺苷脱氨酶、核酸可编程核苷酸结合结构域、以及引导多核苷酸；或者，其包含上述的碱基编辑器融合蛋白，以及引导多核苷酸。
37、在本发明的一些方面，提供了一种药物组合物，其包含上述的腺苷脱氨酶、上述的碱基编辑器融合蛋白、上述的多核苷酸、上述的载体、上述的细胞和上述的碱基编辑器系统中的一种或多种，以及药学上可接受的载体。
38、在本发明的一些方面，提供了一种试剂盒，其包含上述的腺苷脱氨酶、上述的碱基编辑器融合蛋白、上述的多核苷酸、上述的载体、上述的细胞和上述的碱基编辑器系统中的一种或多种。
39、在本发明的一些方面，提供了一种递送系统，其包含上述的腺苷脱氨酶、上述的碱基编辑器融合蛋白、上述的多核苷酸、上述的载体、上述的细胞和上述的碱基编辑器系统中的一种或多种，以及递送介质。
40、在本发明的一些方面，提供了一种核酸的碱基编辑方法，其包括将待被编辑碱基的核酸与上述的碱基编辑器系统相接触的步骤。
41、在本发明的一些方面，提供了上述的腺苷脱氨酶、上述的碱基编辑器融合蛋白、上述的多核苷酸、上述的载体、上述的细胞、上述的碱基编辑器系统、上述的药物组合物或上述的递送系统在制备用于治疗与点突变相关或由点突变引起的疾病的药物中的用途。
42、发明的效果
43、本发明提供的新的腺苷脱氨酶，在构成碱基编辑器及用于碱基编辑器系统时，具有优异的编辑效率以及极窄的编辑窗口，促进了疾病的靶向治疗，并且促进了碱基编辑器在精准治疗中的应用。
1.一种腺苷脱氨酶，其包含以下序列中的一种或多种：
2.根据权利要求1所述的腺苷脱氨酶，其中，所述的取代为在如seq id no:1所示的氨基酸序列的以下位点中的一个或多个发生的取代：
3.根据权利要求2所述的腺苷脱氨酶，所述的取代为在如seq id no:1所示的氨基酸序列的以下位点中的一个或多个发生的取代：s15t、d16e、h17k、f19y、n20q、e22d、y23f、w24f、r26k、h27r、l29i、k33r、r34k、a35s、g80a、l81n、v82a、l83i、q84n、n85s、y86w、i89l、d90g、a91t、t92d、i112l、s113k、r114k、n132k、v133i、l134f、n135h、p137f、g138a和m139l；
4.一种碱基编辑器融合蛋白，其包含如权利要求1～3中任一项所述的腺苷脱氨酶，以及核酸可编程核苷酸结合结构域。
5.根据权利要求4所述的碱基编辑器融合蛋白，其中，所述核酸可编程核苷酸结合结构域为cas蛋白或ago蛋白。
6.根据权利要求4或5所述的碱基编辑器融合蛋白，其中，所述碱基编辑器融合蛋白中还包括至少一条核定位信号序列；
7.根据权利要求4～6中任一项所述的碱基编辑器融合蛋白，其中，所述碱基编辑器融合蛋白包含以下序列中的一种或多种：
8.根据权利要求7所述的碱基编辑器融合蛋白，其中，所述的碱基编辑器融合蛋白包含seq id no:46～53所示序列中的任一种。
9.一种多核苷酸，其编码如权利要求1～3中任一项所述的腺苷脱氨酶或者编码如权利要求4～8中任一项所述的碱基编辑器融合蛋白。
10.一种载体，其包含如权利要求9所述的多核苷酸。
11.一种细胞，其包含如权利要求1～3中任一项所述的腺苷脱氨酶、如权利要求4～8中任一项所述的碱基编辑器融合蛋白、如权利要求9所述的多核苷酸和如权利要求10所述的载体中的一种或多种。
12.一种碱基编辑器系统，其包含如权利要求1～3中任一项所述的腺苷脱氨酶、核酸可编程核苷酸结合结构域、以及引导多核苷酸；
13.一种药物组合物，其包含如权利要求1～3中任一项所述的腺苷脱氨酶、如权利要求4～8中任一项所述的碱基编辑器融合蛋白、如权利要求9所述的多核苷酸、如权利要求10所述的载体、如权利要求11所述的细胞和如权利要求12所述的碱基编辑器系统中的一种或多种，以及药学上可接受的载体。
14.一种试剂盒，其包含如权利要求1～3中任一项所述的腺苷脱氨酶、如权利要求4～8中任一项所述的碱基编辑器融合蛋白、如权利要求9所述的多核苷酸、如权利要求10所述的载体、如权利要求11所述的细胞和如权利要求12所述的碱基编辑器系统中的一种或多种。
15.一种递送系统，其包含如权利要求1～3中任一项所述的腺苷脱氨酶、如权利要求4～8中任一项所述的碱基编辑器融合蛋白、如权利要求9所述的多核苷酸、如权利要求10所述的载体、如权利要求11所述的细胞和如权利要求12所述的碱基编辑器系统中的一种或多种，以及递送介质。
16.一种核酸的碱基编辑方法，其包括将待被编辑碱基的核酸与如权利要求12所述的碱基编辑器系统相接触的步骤。
17.如权利要求1～3中任一项所述的腺苷脱氨酶、如权利要求4～8中任一项所述的碱基编辑器融合蛋白、如权利要求9所述的多核苷酸、如权利要求10所述的载体、如权利要求11所述的细胞、如权利要求12所述的碱基编辑器系统、如权利要求13所述的药物组合物或如权利要求15所述的递送系统在制备用于治疗与点突变相关或由点突变引起的疾病的药物中的用途。
