本发明属于鱼类病理分子诊断，尤其涉及一种基于rpa-crispr-cas12a体系构建的牙鲆弹状病毒检测试剂盒和检测方法。
背景技术：
1、牙鲆弹状病毒（hirame novirhabdovirus, hirrv）是一种具有囊膜不分段的单股负链rna病毒，可引起牙鲆等多种海淡水鱼类病害的重要病毒性病原。hirrv具有传播性强，病程短，致死率高的特点，是牙鲆养殖过程中最常见的疾病之一，给牙鲆养殖业造成了严重危害，同时也给全球的鱼类养殖业带来了潜在威胁。因此，牙鲆弹状病毒病的快速诊断，可帮助养殖户及时采取相应防控措施，有效控制疾病的暴发和流行，降低养殖风险。
2、准确灵敏的分子生物学诊断技术对于hirrv病的早期诊断具有重要意义，对及时遏制该病的暴发与流行至关重要。目前，已报道的hirrv分子检测方法主要包括一步逆转录聚合酶链式反应（rt-pcr）、巢式rt-pcr及rt-qpcr等。但这些方法仍需依赖pcr仪、荧光定量pcr仪等设备，实验操作繁琐、耗时较长，且结果判定不够直观，因此不便在水产现场推广应用。针对病原蛋白的胶体金检测技术虽然可以实现养殖现场的便捷检测，但受限于其灵敏度，当宿主携带低病毒载量时，该技术方法不易检出。hirrv在牙鲆体内具有潜伏感染的特性，鱼体往往会处于带毒不发病的状态，当环境条件恶化及鱼体免疫力下降时，病毒仍具增殖暴发风险，因此开发一种操作便捷、检测灵敏度高的hirrv检测方法对于牙鲆弹状病毒病的防治具有重要价值。
3、近年来，针对人、猪、牛等大型哺乳动物疾病的超高灵敏度快速检测技术的开发与应用已较为成熟，主要是基于重组酶介导的聚合酶扩增技术（rpa）或成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白检测技术（crispr-cas）对组织液加以检测，从而获取直观、极灵敏的检测结果，具有灵敏度超高、简便快捷、价格低廉等一系列优点，在实际检测过程中对仪器的依赖度低，可成功检测潜伏期感染状态，上述技术联用后可进一步提升病原检测灵敏度；此外结合侧向流层析技术（lfd）使检测结果可视化后，可根据显色情况直接判读结果，因此极其适用于养殖现场、基层单位灵敏快速稳定的诊断。
4、但目前尚无针对hirrv的crispr-cas检测方法报道，无法解决hirrv检测技术兼顾检测灵敏度与便捷性的困局，以及同时适用于现场的可视化检测的问题。
技术实现思路
1、针对上述问题，本发明的目的是构建一种现场、快速、灵敏的基于rpa-crispr-cas12a体系检测牙鲆弹状病毒的方法及检测试剂盒，在实现病毒高灵敏检测的基础上，同时具有检测结果肉眼可判的便捷性，可满足hirrv潜伏感染及鱼体低载量携带病毒的检测需求。
2、本发明首次将rpa与crispr技术联合应用于hirrv的检测，同时结合运用侧向流层析技术，该检测体系在大大提升病毒检测灵敏度的同时，还可实现场检测结果肉眼可判，突破了以往hirrv检测技术难以兼顾检测灵敏度与便捷性的困局。
3、为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
4、首先，本发明提供了一种检测牙鲆弹状病毒的crrna，所述crrna的核苷酸序列如seq id no. 1所示。
5、其次，本发明提供了一种检测牙鲆弹状病毒的试剂盒，包括所述的crrna、rpa引物、逆转录酶、cas12a蛋白、ssdna探针；
6、所述rpa引物为primer-f-rpa和primer-r-rpa，primer-f-rpa核苷酸序列如seqid no.6所示，primer-r-rpa核苷酸序列如seq id no.9 所示。
7、所述ssdna探针的核苷酸序列为fam-tttttttattttttt-biotin。
8、最后，本发明还提供一种基于rpa-crispr-cas12a体系检测牙鲆弹状病毒的方法，包括如下步骤：
9、（1）提取待测样品总rna；
10、（2）以步骤（1）中的总rna为模板，利用所述rpa引物进行等温扩增反应，得到rpa扩增产物；
11、（3）利用步骤（2）获取的rpa扩增产物，以及cas12a蛋白、ssdna探针、所述的crrna分子在crispr-cas12a反应体系里反应，获得反应体系溶液；
12、（4）对步骤（3）的反应体系溶液进行试纸条检测，当试纸条t线显色，则表示待测样品hirrv病毒阳性，当试纸条只有c线显色，则表示待测样品hirrv病毒阴性。
13、步骤（1）所述提取待测样品总rna包括如下步骤：1、取2mm左右的牙鲆脾脏组织块用小型研磨器研磨，然后向研磨的组织中加200μl无酶depc水；2、加入250μl的无机磷酸盐缓冲液、20μl的蛋白酶k和1.0μl的核糖核酸载体，剧烈振荡使其充分混匀，56℃孵育15min；裂解后室温13000g离心3min，将上清转移至新的1.5ml离心管中；向上清中加入250μl无水乙醇，充分吸打混匀；3、将裂解液转移至病毒核酸吸附柱中，温室静置2min，13000g离心2min，弃滤液；4、向病毒核酸吸附柱中加入500μl的异硫氰酸胍缓冲液，温室13000g离心1min，弃滤液；5、向病毒核酸吸附柱中加入750μl的tris-hcl乙醇缓冲液，温室13000g离心1min，弃滤液；6、重复步骤5；7、将病毒核酸吸附柱安置于新的2ml无酶离心管上，温室13000g离心2min；8、将病毒核酸吸附柱安置于新的1.5ml的离心管上，在病毒核酸吸附柱膜的中央加入40μl无酶depc水，温室静置5min，然后温室13000g，离心2min，得脾脏总rna。
14、步骤（2）所述等温扩增反应体系包括：rpa缓冲液29.5μl，primer-f-rpa 2.4μl，primer-r-rpa 2.4μl，ddh2o 8.2μl，含有基因组rna的样品上清液4μl，mgoac 2.5μl和逆转录酶（m-mulv）0.5μl，总体积为50.5μl，于40℃反应32min。
15、步骤（3）所述crispr-cas12a反应体系包括：ssdna探针2μl，缓冲液2μl，crrna2μl，cas12a蛋白2μl，rpa扩增产物4μl，ddh2o 8μl，总体积为20μl，于37℃反应15min。
16、本发明还提供了所述的检测方法在牙鲆弹状病毒病诊断中的应用。
17、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
18、（1）本发明首次设计出识别牙鲆弹状病毒n基因组的crrna，该crrna具有高度特异性。
19、（2）本发明基于重组酶聚合酶扩增结合crispr-cas12a技术，具有超高灵敏度及特异性的特点，对不同拷贝数hirrv n基因片段的检测结果表明，灵敏度可低至8.7拷贝/μl，检测灵敏度远高于常规pcr，可以在感染潜伏期检测出牙鲆弹状病毒，从而对牙鲆弹状病毒病进行防治。
20、（3）本发明具有可视化，操作简单的优点，可直接通过肉眼观察试纸条显色结果来判定检测结果，特别适合于在水产现场推广应用。
1.一种检测牙鲆弹状病毒的crrna，其特征在于，所述crrna的核苷酸序列如seq idno. 1所示。
2.一种检测牙鲆弹状病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的crrna。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括rpa引物，所述rpa引物为primer-f-rpa和primer-r-rpa；所述primer-f-rpa核苷酸序列如seq id no.6所示，所述primer-r-rpa核苷酸序列如seq id no.9所示。
4.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，还包括逆转录酶、cas12a蛋白、ssdna探针。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述ssdna探针的核苷酸序列为fam-tttttttattttttt-biotin。
6.一种基于rpa-crispr-cas12a体系检测牙鲆弹状病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）提取待测样品基因组rna；（2）以步骤（1）中的基因组rna为模板，利用权利要求3中所述rpa引物进行等温扩增反应，得到rpa扩增产物；（3）利用步骤（2）获取的rpa扩增产物，以及cas12a蛋白、ssdna探针、权利要求1所述的crrna分子在crispr-cas12a反应体系里反应，获得反应体系溶液；（4）对步骤（3）的反应体系溶液进行试纸条的检测，当试纸条t线显色，则表示待测样品hirrv病毒阳性，当试纸条只有c线显色，则表示待测样品hirrv病毒阴性。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述提取待测样品基因组rna包括如下步骤：1、取2mm左右的牙鲆脾脏组织块用小型研磨器研磨，然后向研磨的组织中加200μl无酶depc水；2、加入250μl的无机磷酸盐缓冲液、20μl的蛋白酶k和1.0μl的核糖核酸载体，剧烈振荡使其充分混匀，56℃孵育15min；裂解后室温13000g离心3min，将上清转移至新的1.5ml离心管中；向上清中加入250μl无水乙醇，充分吸打混匀；3、将裂解液转移至病毒核酸吸附柱中，温室静置2min，13000g离心2min，弃滤液；4、向病毒核酸吸附柱中加入500μl的异硫氰酸胍缓冲液，温室13000g离心1min，弃滤液；5、向病毒核酸吸附柱中加入750μl的tris-hcl乙醇缓冲液，温室13000g离心1min，弃滤液；6、重复步骤5；7、将病毒核酸吸附柱安置于新的2ml无酶离心管上，温室13000g离心2min；8、将病毒核酸吸附柱安置于新的1.5ml的离心管上，在病毒核酸吸附柱膜的中央加入40μl无酶depc水，温室静置5min，然后温室13000g，离心2min，得脾脏总rna。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述等温扩增反应体系包括：rpa缓冲液29.5μl，primer-f-rpa 2.4μl，primer-r-rpa 2.4μl，ddh2o 8.2μl，含有基因组rna的样品上清液5μl和mgoac 2.5μl，逆转录酶0.5μl，总体积为50.5μl，于40℃反应32min。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述crispr-cas12a反应体系包括：ssdna探针2μl，缓冲液2μl， crrna 2μl，cas12a蛋白2μl，rpa扩增产物4μl，ddh2o 8μl，总体积为20μl，于37℃反应15min。
10.权利要求6～9任意一项所述的检测方法在检测牙鲆弹状病毒中的应用。
