本发明属于磷酸化肽段富集，涉及一种一次富集实现单磷酸化肽段与多磷酸化肽段分离的方法。
背景技术：
1、在开展高深度覆盖的磷酸化组学实验中，质谱分析多磷酸化肽段是其中的一个巨大挑战。多磷酸化肽段在质谱离子化的过程中，它的信号通常会被单磷酸化肽段或者非磷酸化肽段抑制。其次，多磷酸化肽段的丰度往往低于单磷酸化肽段的丰度，而质谱的dda采集模式(data dependent acquisition，数据依赖性采集)只会选择碎裂相对高丰度的母离子。因此，多磷酸化肽段鉴定变得非常困难。为了有效解决这一矛盾，我们可以通过富集技术实现单磷酸化肽段和多磷酸化肽段的分离，从而更加高效地鉴定多磷酸化肽段，提升样本的磷酸化修饰位点鉴定覆盖度。
2、目前最新以及最高效分离单磷酸化与多磷酸化肽段的文献(sequential elutionfrom imac(simac):an efficient method for enrichment and separation of mono-and multi-phosphorylated peptides)，该文献先采用fe-imac技术对单磷酸化和多磷酸化肽段进行初始的富集和分离，随后采用tio2(二氧化钛)技术富集其中的单磷酸化肽段。该方法在一定程度上实现了单磷酸化肽段和多磷酸化肽段的分离，但是其分离效果并不理想。可见目前对单磷酸化和多磷酸化肽段的分离，主要通过富集来进行分离，且至少需要2次富集才能实现单磷酸化肽段和多磷酸化肽段的分离，工作效率不高。而且fe-imac和tio2富集材料相对比较昂贵，同时需要两种材料实现单磷酸化肽段和多磷酸化肽段的分离，成本较大。
3、cn103102388a提供了一种反相/强阳离子交换混合模式材料顺序富集多磷酸化和单磷酸化肽，其采用一种制备过程非常复杂的材料来分离多磷酸化和单磷酸化肽段，并采用同一种酸性洗脱液进行洗脱，根据多磷酸化肽段和单磷酸化肽段被洗脱下来的顺序不同来分离多磷酸化和单磷酸化肽段，该方法不仅操作过程难以控制，且多磷酸化和单磷酸化肽段的分离效果也很不好，无法真正解决实现单磷酸化肽段和多磷酸化肽段的分离和精确检测。
4、因此急需找到一种更加简便高效、材料获取方便、低成本的分离单磷酸化肽段和多磷酸化肽段的方法。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种一次富集实现单磷酸化肽段与多磷酸化肽段分离的方法，通过fe-imac材料一次富集，再经两次洗脱，第一次采用20％乙腈0.3％乙酸的酸性洗脱液洗脱出单磷酸化肽段，第二次采用100mm磷酸氢二钾碱性洗脱液洗脱出多磷酸化肽段，实现单磷酸化肽段与多磷酸化肽段的高效分离，从而实现精确鉴定，提升样本的磷酸化修饰位点鉴定覆盖度。
2、一方面，本发明提供了一种一次富集实现单磷酸化肽段与多磷酸化肽段分离的方法，所述方法包括以下步骤：
3、(1)采用fe-imac材料富集含有磷酸化肽段的溶液；
4、(2)采用第一洗脱液进行洗脱，第一洗脱液为酸性洗脱液；
5、(3)采用第二洗脱液进行洗脱，第二洗脱液为碱性洗脱液。
6、所述的单磷酸化肽段是指一条多肽中只有一个磷酸化基团；多磷酸化肽段是指一条多肽种含有两个及以上的磷酸化基团。
7、所述的fe-imac(fe3+-immobilized metal affinity chromatography)材料是一种三价铁离子固相金属亲和层析材料。fe-imac材料价格便宜，获取方便，且能实现单磷酸化肽段和多磷酸化肽段的高效分离。
8、本方法采用fe-imac技术，一次富集，两步洗脱(通过改变两种洗脱液的成分)，就可实现单磷酸化肽段和多磷酸化肽段的依次洗脱，高效分离。
9、在酸性溶液中，磷酸化肽段由于其带有磷酸化基团使其带负电。而fe-imac材料螯合了三价铁离子带正电。因此基于正负电相吸的原理，磷酸化肽段会与fe-imac材料结合。利用这一原理，可以将肽段中的磷酸化肽段与非磷酸化肽段进行有效地分离。
10、但是，随着酸性溶液的酸性进一步加强，单磷酸化肽段与fe-imac材料的结合能力会逐渐减弱，从而脱离了材料。而多磷酸化肽段由于其含有多个磷酸化基团，即使溶液中的酸性增加，它们与fe-imac材料的结合能力要强与单磷酸化肽段。利用这个原理我们可以通过增加溶液中的酸性从而分离得到单磷酸化肽段。剩下的与材料结合的多磷酸化肽段我们利用碱性洗脱液洗脱，由于碱性洗脱液可以破坏磷酸化肽段和材料的结合，洗脱跟材料结合的所有磷酸化肽段。
11、在磷酸化肽段样本中，通常含有大量的单磷酸化肽段，而多磷酸化肽段却只有少部分，导致多磷酸化肽段的丰度往往低于单磷酸化肽段的丰度，而质谱的dda采集模式(data dependent acquisition，数据依赖性采集)只会选择碎裂相对高丰度的母离子，使多磷酸化肽段的鉴定比较困难，进而使得质谱鉴定到的多磷酸化肽段数目不能真实反应溶液中的多磷酸化肽段数目。为了能更精确地鉴定多磷酸化肽段数量，需要尽量将多磷酸化肽段与单磷酸化肽段分离后再进行鉴定。
12、由于，碱性洗脱液洗脱为强洗脱步骤，能通过碱性洗脱液破坏磷酸化肽段和材料的结合，完全洗脱下跟材料结合的所有剩余的磷酸化肽段。因此为了实现多磷酸化肽段与单磷酸化肽段更好地分离，关键在于控制第一次酸性洗脱的效果，只有当酸性洗脱液洗脱过程中，能尽量洗下全部的单磷酸化肽段，并能尽量防止多磷酸化肽段被洗下，才能保证在第二次的碱性强洗脱时，洗脱下来的是更多的多磷酸化肽段。
13、进一步地，步骤(2)所述的第一洗脱液为含有乙腈和乙酸的酸性洗脱液，ph 2-5；经第一洗脱液洗脱得到单磷酸化肽段溶液。
14、实际操作中我们会发现，在酸性洗脱液洗脱过程中，也会有少量的多磷酸化肽段被洗下，此时第一洗脱液洗下的组分在进行质谱检测时，多磷酸化肽段的鉴定会被丰度更高的单磷酸化肽段所抑制，可能检测到了大量单磷酸化肽段，而只检测到少量的多磷酸化肽段甚至未检测到多磷酸化肽段；如果第一步洗脱液洗脱下来的成分中多磷酸化肽段数目太多，必然会导致第二步碱性洗脱液洗脱下来的成分中多磷酸化肽段的真实数目过少，且由于单磷酸化肽段的抑制，使得最终鉴定到多磷酸化肽段数目明显减少。所以，酸性洗脱液的选择是本发明的关键，只有当选择了能洗下尽量多的单磷酸化肽段，并且不会洗下或洗下尽量少的多磷酸化肽段，才能在第二次的强洗脱时洗脱下更多的多磷酸化肽段，从而使单磷酸化肽段和多磷酸化肽段得到更完全地分离。
15、本发明经大量实验发现，采用含有乙腈和乙酸的酸性洗脱液，能洗下近乎全部的单磷酸化肽段，且只有极少量的多磷酸化肽段被洗下，对单磷酸化和多磷酸化肽段的分离效果最好，同时还进一步摸索了乙腈的浓度以及乙酸的浓度，来达到最佳的分离效果。
16、进一步地，步骤(3)所述的第二洗脱液为含有碱性洗脱液，ph 8-11；经第二洗脱液洗脱得到多磷酸化肽段溶液。
17、步骤(3)所述的采用碱性洗脱液洗脱为强洗脱步骤，关键在于能通过碱性洗脱液破坏磷酸化肽段和材料的结合，洗脱跟材料结合的所有剩余的磷酸化肽段。因此可选用磷酸氢二钾溶液、氨水等碱性洗脱液来洗脱，只需要能完全洗脱下剩余磷酸化肽段即可。
18、在一些方式中，由于磷酸氢二钾溶液本身呈碱性，可以破坏磷酸化肽段和材料的结合，而且其能电离出磷酸根，竞争性洗脱磷酸化肽段。因此优选采用磷酸氢二钾碱性洗脱液能够来充分洗脱跟材料结合的所有磷酸化肽段。
19、进一步地，第一洗脱液为10～30％乙腈0.15～0.3％乙酸溶液；第二洗脱液为100mm磷酸氢二钾溶液。
20、进一步地，第一洗脱液为20％乙腈0.3％乙酸溶液。
21、本发明比较了多种酸性洗脱液作为第一洗脱液的效果，研究证明，采用20％乙腈0.3％乙酸溶液作为第一洗脱液时，能洗下绝大部分的单磷酸化肽段，基本很少有多磷酸化肽段被洗下，也就是说绝大部分的多磷酸化肽段都留到了第二洗脱液的强洗脱过程中，从而更好地保证了多磷酸化肽段与单磷酸化肽段分离效果，实现质谱对多磷酸化肽段的精确鉴定。
22、进一步地，第二洗脱液为100mm磷酸氢二钾溶液。
23、进一步地，步骤(1)为：取肽段与fe-imac材料室温旋转孵育，离心弃上清。
24、进一步地，步骤(1)为：取肽段与fe-imac材料室温旋转孵育30min，离心弃上清，再经洗涤缓冲液(60％乙腈0.1％乙酸溶液)洗涤两次。
25、进一步地，还包括步骤(4)：分别将第一洗脱液洗脱得到的单磷酸化肽段溶液，或第二洗脱液洗脱得到的多磷酸化肽段溶液进行真空浓缩、除盐，质谱检测。
26、经本发明提供的方法分离得到的单磷酸化肽段组分和多磷酸化肽段组分，经真空浓缩、除盐，就可以进行质谱上机，检测单磷酸化肽段与多磷酸化肽段的分离效果。
27、另一方面，本发明提供了一种溶液用于制备经fe-imac技术富集的肽段中的单磷酸化肽段的洗脱液的用途，所述溶液为20％乙腈0.3％乙酸溶液。
28、再一方面，本发明提供了一种溶液用于制备经fe-imac技术富集的肽段中的多磷酸化肽段的洗脱液的用途，所述溶液为100mm磷酸氢二钾溶液。
29、本发明的有益效果为：
30、(1)采用低成本且获取方便的fe-imac材料进行分离，仅需一次富集，两次洗脱，就可实现单磷酸化肽段和多磷酸化肽段的高效分离，从而实现精确鉴定，提升样本的磷酸化修饰位点鉴定覆盖度；
31、(2)发现采用20％乙腈0.3％乙酸溶液作为酸性洗脱液能洗下绝大部分的单磷酸化肽段，基本很少有多磷酸化肽段被洗下，从而保证了绝大部分的多磷酸化肽段都留到了第二洗脱液的强洗脱过程中，显著提升了多磷酸化肽段与单磷酸化肽段的分离效果，实现了质谱对多磷酸化肽段的精确鉴定；
32、(3)获得的多磷酸化肽段组分中多磷酸化肽段占比87％，单磷酸化肽段组分中单磷酸化肽段占比99％；
33、(3)简便高效、成本低。
1.一次富集实现单磷酸化肽段与多磷酸化肽段分离的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的第一洗脱液为含有乙腈和乙酸的酸性洗脱液；经第一洗脱液洗脱得到单磷酸化肽段溶液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的第二洗脱液为ph8～10的碱性洗脱液；经第二洗脱液洗脱得到多磷酸化肽段溶液。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，第一洗脱液为10～30％乙腈0.15～0.3％乙酸溶液；第二洗脱液为100mm磷酸氢二钾溶液。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一洗脱液为20％乙腈0.3％乙酸溶液；第二洗脱液为100mm磷酸氢二钾溶液。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)为：取肽段与fe-imac材料室温旋转孵育，离心弃上清。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)为：取肽段与fe-imac材料室温旋转孵育30min，离心弃上清，再经洗涤缓冲液洗涤两次。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括步骤(4)：分别将第一洗脱液洗脱得到的单磷酸化肽段溶液，或第二洗脱液洗脱得到的多磷酸化肽段溶液进行真空浓缩、除盐，质谱检测。
9.一种溶液用于制备经fe-imac技术富集的肽段中的单磷酸化肽段的洗脱液的用途，其特征在于，所述溶液为20％乙腈0.3％乙酸溶液。
10.一种溶液用于制备经fe-imac技术富集的肽段中的多磷酸化肽段的洗脱液的用途，其特征在于，所述溶液为100mm磷酸氢二钾溶液。
