本发明涉及一种检测甲壳动物血细胞自噬水平的方法，具体涉及一种检测梭子蟹血细胞自噬水平的方法，属于细胞生物学检测。
背景技术：
1、自噬是一种高度保守的细胞降解和循环过程，存在于所有真核生物中。细胞自噬水平增强是促进自身生存的早期反应，但是过度或长时间的损伤会诱导病理性自噬的激活，从而导致细胞死亡和组织损伤。环境胁迫会导致机体出现氧化应激，破坏细胞内细胞器和蛋白结构，导致细胞损伤甚至引起细胞死亡。这种情况下，动物机体能够通过自噬途径清除受损的细胞器和蛋白，维持细胞的能量代谢，保证细胞器的更新和修复。当细胞自噬能力受到损害时，会引起细胞凋亡和坏死，最终产生不可逆的损伤。
2、与脊椎动物相比，甲壳动物不具备特异性免疫系统，缺乏免疫球蛋白和特异性免疫淋巴细胞，主要依靠体液和细胞介导的非特异性免疫系统来防御和清除病原体及外来异物。血细胞是甲壳动物非特异性免疫的主要参与者，是机体抵御缺氧、高温、高氨氮或重金属污染等环境胁迫的一道重要防线。近年来，随着细胞化学染色的发展以及透射电镜、免疫组化等技术的广泛应用，关于甲壳动物血细胞的分类取得极大进展。然而，目前对于梭子蟹血细胞自噬水平测定的研究仍属空白，尚无有效检测梭子蟹血细胞自噬水平的技术。自噬被认为是梭子蟹血细胞的自我保护机制之一，对于维持其血细胞的结构、数量、功能至关重要。因此，亟需开发一种检测梭子蟹血细胞自噬水平的方法。从细胞水平探究甲壳动物细胞自噬规律及机理，丰富甲壳动物抗逆机制研究，助推产业绿色发展。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种检测梭子蟹血细胞自噬水平的方法，以填补现有甲壳动物血细胞自噬研究的空白。
2、一种检测梭子蟹血细胞自噬水平的方法，包括以下步骤：
3、步骤1，通过环境胁迫激活梭子蟹血细胞自噬并采集血淋巴；
4、其特征是还包括以下步骤：
5、步骤2，制备环境胁迫前后梭子蟹血细胞悬液；
6、步骤3，利用透射电镜鉴定环境胁迫前后的梭子蟹血细胞悬液自噬体超微结构；
7、步骤4，酶联免疫吸附测定（elisa）梭子蟹血细胞自噬相关蛋白水平；
8、步骤5，实时荧光定量（qrt - pcr）分析梭子蟹血细胞自噬相关基因表达水平变化，包括以下步骤：
9、使用transzol up rna试剂盒提取血细胞悬液样品中总rna，每组中的样品均进行采样；
10、通过1%琼脂糖凝胶电泳检测rna完整度，设置参数为电压150 v、时间20 min；
11、超微量分光光度计nanodrop 2000测定rna的纯度和浓度，rna 260 / 280 值在1.8 ~ 2.2之间视为合格；
12、取800 ng rna，用evo m-mlv逆转录试剂盒构建cdna文库；
13、利用引物设计软件设计基因引物序列，自噬相关基因包括 lc3a，p62，becn1，mtor， ampk，lamp， β-actin作为内参基因；
14、通过cfx96touch实时荧光定量系统，用sybr® green pro taq hs预混型荧光定量pcr试剂盒（ag，ag11701）检测自噬相关基因相对表达量；
15、步骤6，利用激光共聚焦显微镜定性检测环境胁迫前后的血细胞悬液中血细胞自噬水平；
16、步骤7，基于前向散射光（fsc）和侧向散射光（ssc）指标，对环境胁迫前后的血细胞悬液进行流式细胞检测，圈定不同细胞亚群并构建回归模型；
17、步骤8，利用流式细胞术定量检测环境胁迫后的梭子蟹血细胞自噬水平；
18、步骤9，结合溶酶体活性检测梭子蟹血细胞自噬的效果。
19、步骤2所述血细胞悬液制备包括以下步骤：
20、取不少于3组梭子蟹，每组随机选相同数量的个体（不少于3只），用5 ml注射器抽取血淋巴进行混样，获取的样本加入等量预冷的特定抗凝剂混匀，抗凝剂配方为4.2 g·l-1氯化钠、8 g·l-1柠檬酸钠、20.5 g·l-1葡萄糖，用盐酸调节ph = 7.5；
21、然后经75 µm细胞筛过滤，过滤液于4 ℃，300 g下离心10 min，弃去上清液，沉淀即为血细胞样品；
22、用pbs缓冲液重悬血细胞样品并通过自动细胞计数器将细胞数调节至5 ~ 10 ×105个/ml。
23、步骤3利用透射电镜鉴定环境胁迫前后梭子蟹血细胞产生的自噬体超微结构，以观察血细胞的结构变化，包括以下步骤：
24、环境胁迫前后梭子蟹血细胞悬液中分别加入2.5%戊二醛，于4 ℃固定4 h，接着用pbs缓冲液冲洗３次，每次于300g，4 ℃下离心10 min；
25、然后用1% 锇酸4 ℃固定2 h，pbs缓冲液冲洗3次，每次于300g，4 ℃离心10 min；
26、依次加入30%、50%、70%、90%、100%的乙醇进行脱水，每次10 min，其中100%乙醇脱水两次；
27、之后使用epon812环氧树脂进行包埋，置于温箱内按照37 ℃、45 ℃、65 ℃的温度进行固化，每级温度固化24 h；
28、固化结束后，先半薄切片定位，然后使用超薄切片机制作80 ~ 85 nm厚度的超薄切片；
29、用醋酸双氧铀硝酸铅将切片染色，染色后将切片置于透射电子显微镜下观察。
30、步骤4酶联免疫吸附测定梭子蟹血细胞自噬相关蛋白水平包括以下步骤：
31、用beclin-1 elisa商业试剂盒检测血细胞beclin-1蛋白的表达水平；
32、用lc3-ii elisa商业试剂盒检测血细胞lc3-ii蛋白的表达水平。
33、步骤5-（6）中采用cfx96touch实时荧光定量系统，用sybr®green pro taq hs预混型荧光定量pcr试剂盒（ag，ag11701）检测自噬相关基因相对表达量，包括如下步骤：
34、反应体系为：20 μl，包含10 μl 2x sybr® green pro taq hs premix ii、2 μl稀释的cdna、0.8 μl正向引物、0.8 μl反向引物和7.2 μl无酶水。
35、反应程序为：95 ℃，30 s，循环一次；95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，40个循环。
36、步骤6利用激光共聚焦显微镜定性检测梭子蟹血细胞自噬体水平，以鉴定血细胞在荧光探针标记下发生自噬的情况，包括以下步骤：
37、使用cyto - id®自噬检测试剂盒，取1 µl绿色检测试剂，溶于1 ml自噬检测缓冲液内制成工作液；
38、取400 µl血细胞悬浮液，分别加入400 µl工作液和1 µl hoechst 33342核染色剂，混匀后室温避光孵育1 h；
39、取20 µl血细胞悬液，通过cyto - id®荧光探针标记血细胞中的自噬体，通过激光共聚焦显微镜于488 nm激发光下分析染色细胞；
40、使用标准fitc滤波器组对自噬信号进行成像，并使用dapi滤波器组对细胞核进行成像。
41、步骤7对环境胁迫前后的血细胞悬液进行流式细胞检测，圈定不同细胞亚群并构建回归模型，包括以下步骤：
42、fsc反映细胞大小，ssc反映细胞复杂程度（即细胞内颗粒度），通过fsc-ssc流式等高线分析，梭子蟹血细胞分为透明细胞和颗粒细胞两类，并分别计数；
43、计算透明细胞与颗粒细胞数量比值；
44、通过r语言构建不同环境胁迫时间下两种细胞数量比值的回归模型。
45、步骤8利用流式细胞术定量检测梭子蟹血细胞自噬水平包括以下步骤：
46、使用cyto - id®自噬检测试剂盒，取1 µl绿色检测试剂，溶于1 ml自噬检测缓冲液内制成工作液；
47、取400 µl血细胞悬浮液，加入400 µl工作液，混匀后于室温下避光孵育1 h；
48、孵育结束后，于室温中600 g离心5 min，用pbs洗涤一次血细胞并重悬于400 µl× 1 ml自噬检测缓冲液中，通过cyto - id®荧光探针标记血细胞中的自噬体；
49、使用cytoflex s流式细胞仪fitc滤波器定量分析荧光信号强度；
50、流式细胞仪区分出阴性血细胞（cyto id®未标记）和阳性血细胞（cyto id®标记）；根据阳性血细胞占总血细胞的比例来反映血细胞自噬水平。
51、步骤9结合溶酶体活性检测梭子蟹血细胞自噬效果包括以下步骤：
52、取400 µl血细胞悬液加入1 µl溶酶体绿色荧光探针，混匀后室温避光孵育30min；
53、孵育结束后，室温600 g离心5 min，用pbs缓冲液洗涤细胞一次并重悬于400 µlpbs缓冲液中；
54、立即通过cytoflex s流式细胞仪fitc滤波器检测绿色荧光信号强度；
55、计算每组血细胞平均荧光强度与对照组对应时间点平均荧光强度的比值，即为溶酶体活性。
56、本发明首先通过环境胁迫激活梭子蟹血细胞自噬并制备血细胞悬液，利用透射电镜观察环境胁迫前后血细胞的自噬体结构，自噬体结构包括双层结构的自噬体（avi：自噬早期标志）和单层膜结构的自噬溶酶体（avd：自噬晚期结构），不同的自噬体结构表示血细胞自噬发生的不同时期；然后测定自噬相关蛋白（lc3-ii和beclin-1）和特定基因（ lc3， p62，becn1，mtor，ampk，lamp）的表达水平及血细胞溶酶体活性，来检测自噬体形成与降解途径的变化；进一步，利用fsc-ssc流式等高线分析，鉴定血细胞类群并计数，通过构建不同环境胁迫时间下两种细胞比值的回归模型来检测自噬的发生情况；用激光共聚焦显微和流式细胞术检测发生自噬的血细胞数量和自噬体的数量，采用血细胞中发生自噬的细胞所占的百分比判别细胞发生自噬的程度；最终综合全方面指标鉴定梭子蟹血细胞自噬水平。
57、本发明具有如下优点：
58、本发明首次提出了一种检测梭子蟹血细胞自噬水平的方法，可以对血细胞自噬体结构进行定性与定量分析，并进一步通过荧光蛋白、基因表达和溶酶体活性验证自噬体形成与降解途径的变化，综合确定血细胞自噬规律特征，为后续研究各种条件下自噬对血细胞的结构、形态及功能的影响奠定基础。
59、本发明首次发现梭子蟹血细胞亚群分为透明细胞和颗粒细胞，并通过r语言构建不同环境胁迫时间下两种细胞数量比值的回归模型，模型显示24h内随着自噬水平的变化，透明细胞与颗粒细胞数量的比例呈先升高后下降的变化。
60、本发明所述的一种检测梭子蟹血细胞自噬水平的方法，通过特定的抗凝剂制备出可用于流式细胞等上机操作的梭子蟹血细胞悬液，并基于流式细胞术圈定血细胞亚群，对后续甲壳动物血细胞的功能研究提供了便利。
61、本发明鉴定了6个与梭子蟹自噬相关的基因，通过设计特异性引物序列测定血细胞中自噬相关基因的相对表达量，结合自噬标志蛋白表达变化，明确梭子蟹血细胞自噬的发生与调控。
62、本发明的方法可推广到对于甲壳类动物血细胞自噬水平的检测。
1.一种检测梭子蟹血细胞自噬水平的方法，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述一种检测梭子蟹血细胞自噬水平的方法，其特征是步骤2所述血细胞悬液制备包括以下步骤：
3.如权利要求1所述一种检测梭子蟹血细胞自噬水平的方法，其特征是步骤3利用透射电镜鉴定环境胁迫前后梭子蟹血细胞产生的自噬体超微结构，以观察血细胞的结构变化，包括以下步骤：
4.如权利要求1所述一种检测梭子蟹血细胞自噬水平的方法，其特征是步骤4酶联免疫吸附测定梭子蟹血细胞自噬相关蛋白水平包括以下步骤：
5.如权利要求1所述一种检测梭子蟹血细胞自噬水平的方法，其特征是步骤5-（6）中采用cfx96touch实时荧光定量系统，用sybr®green pro taq hs预混型荧光定量pcr试剂盒检测自噬相关基因相对表达量，包括如下步骤：
6.反应程序为：95 ℃，30 s，循环一次；95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，40个循环。
7.如权利要求1所述一种检测梭子蟹血细胞自噬水平的方法，其特征是步骤6利用激光共聚焦显微镜定性检测梭子蟹血细胞自噬体水平，以鉴定血细胞在荧光探针标记下发生自噬的情况，包括以下步骤：
8.如权利要求1所述一种检测梭子蟹血细胞自噬水平的方法，其特征是步骤7对环境胁迫前后的血细胞悬液进行流式细胞检测，圈定不同细胞亚群并构建回归模型，包括以下步骤：
9.如权利要求1所述一种检测梭子蟹血细胞自噬水平的方法，其特征是步骤8利用流式细胞术定量检测梭子蟹血细胞自噬水平，包括以下步骤：
10.如权利要求1所述一种检测梭子蟹血细胞自噬水平的方法，其特征是步骤9结合溶酶体活性检测梭子蟹血细胞自噬效果包括以下步骤：
