本发明涉及生物中水稻抗逆性相关蛋白gnp3及其编码基因与应用。
背景技术：
1、干旱、盐碱、低温及病原体侵染等逆境胁迫会严重影响作物的生长发育，进而对产量造成严重影响。水稻在热带和亚热带地区进化，对冷胁迫敏感。冷害影响营养生长(发芽和幼苗)和生殖生长(孕穗期和开花)阶段。
2、干旱是作物生产的持续障碍，特别是在全球气候变化和农业用水需求不断增长的背景下，培育水稻需水量少，抗旱能力强的品种抵抗是迫切需要的。
3、中国是世界第三大盐碱土国家，90％以上为内陆盐碱地，可利用耐盐碱水稻种植的盐碱地约1000万hm2，加强耐盐碱水稻的研发对确保中国粮食安全具有重要的战略意义。
4、稻瘟病又名稻热病、火烧瘟、叩头瘟等，是由稻瘟病原菌引起的、发生在水稻的一种病害。稻瘟病在水稻整个生育期中都可发生，为害秧苗、叶片、穗、节等，分别称为苗瘟、叶瘟、穗瘟和节瘟。
5、因此，找一个与水稻抗逆性相关的基因是被领域迫切解决的技术问题。
技术实现思路
1、本发明解决的技术问题是提高植物抗逆性，尤其是水稻。
2、为了解决上述问题，本发明提供了下述应用。
3、蛋白质、调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在下任一种中的应用；
4、a1)提高禾本科植物抗逆性中的应用和/或制备提高禾本科植物抗逆性产品中的应用；
5、所述蛋白质为如下任一种蛋白质：
6、b1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
7、b2)将b1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与b1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
8、b3)将b1)或b2)的n末端或/和c末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
9、上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
10、上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
11、上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
12、上述蛋白质中，序列2(seq id no.2)由654个氨基酸残基组成。将其命名为gnp3蛋白。其编码基因为gnp3基因。
13、本技术中，所述调控可为过上调或增强或提高，和/或，敲除或降低或减少。
14、本技术中，所述过上调或增强或提高所述蛋白质的编码基因表达的物质或所述蛋白质的活性或含量可提高禾本科植物抗逆性。敲除或降低或减少所述蛋白质的编码基因表达的物质或所述蛋白质的活性或含量可降低禾本科植物抗逆性。
15、上述的应用中，所述蛋白来源于水稻。
16、上文中，所述水稻可为日本晴。
17、上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
18、上述的应用中，所述调控所述蛋白质的编码基因表达的物质为下述任一种：
19、b1)、编码上述蛋白质的核酸分子；
20、b2)、含有b1)所述核酸分子的表达盒；
21、b3)、含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；
22、b4)、含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；
23、b5)、含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有b3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
24、b6)、含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有b3)所述重组载体的转基因植物组织；
25、b7)、含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有b3)所述重组载体的转基因植物器官；
26、b8)、抑制或降低或下调上述蛋白质的编码基因的表达或抑制或降低或下调所述蛋白质的活性或含量的核酸分子；
27、b9)、表达b8)所述核酸分子的编码基因；
28、b10)、含有b9)所述基因的表达盒；
29、b11)、含有b9)所述基因的重组载体、或含有b10)所述表达盒的重组载体；
30、b12)、含有b9)所述基因的重组微生物、或含有b10)所述表达盒的重组微生物、或含有b11)所述重组载体的重组微生物；
31、b13)、含有b9)所述基因的转基因植物细胞系、或含有b10)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有b11)所述重组载体的转基因植物细胞系；
32、b14)、含有b9)所述基因的转基因植物组织、或含有b10)所述表达盒的转基因植物组织、或含有b11)所述重组载体的转基因植物组织；
33、b15)、含有b9)所述基因的转基因植物器官、或含有b10)所述表达盒的转基因植物器官、或含有b11)所述重组载体的转基因植物器官。
34、b1)或b8)所述核酸分子中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质gnp3的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质gnp3的核苷酸序列80％或80％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质gnp3且具有蛋白质gnp3功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
35、上述80％或80％以上同一性，可为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
36、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
37、本文中，所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、ti质粒或病毒载体。
38、上述生物材料中，b2)或b9)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述基因的dna，该dna不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plant physiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂ii启动子(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128(cn101063139b(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(beachy等人(1985)embo j.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv 35s终止子、tml终止子、豌豆rbcs e9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：odell等人(i985)nature 313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genes dev.,5:141；mogen等人(1990)plant cell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleic acids res.17:7891；joshi等人(1987)nucleic acid res.,15:9627)。
39、上述b3)或b11)中，所述重组载体可为用植物表达载体构建含有所述基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体可为gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pgwb411、pgwb412、pgwb405、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa、pmdc85或pcambia1391-xb。使用gnp3构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、泛生素基因ubiqutin启动子(pubi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。作为一个具体实施例，本技术使用pcm1307载体作为表达载体。作为一个具体实施例，所述重组微生物中的微生物菌株可为农杆菌eha105。
40、上述的应用中，b9)所述的核酸分子为核苷酸序列为序列1所示的dna分子。
41、为了解决上述问题，本发明还提供了一种培育高抗逆性水稻的方法。
42、所述方法包括上调或增强或提高目的水稻中上述述蛋白质的编码基因的表达量，和/或，所述蛋白质的活性和/或含量得到高抗逆性水稻，所述高抗逆性水稻的抗逆性高于所述目的水稻。
43、为了解决上述问题，本发明还提供了一种提高水稻抗逆性的方法。
44、所述方法包括将通过上调或增强或提高水稻中上述蛋白质的编码基因的表达，和/或，所述上述蛋白质的活性和/或含量来提高水稻抗逆性。
45、本技术中，所述水稻可为日本晴。
46、本技术中，所述抗逆行可为苗期抗逆性。所述苗期可为两叶一心期或出芽三周。
47、本技术中，所述抗逆性可为抗旱性、抗盐性(耐盐性)、抗冷性和抗菌性
48、本技术中，所述抗菌性可为菌胁迫下的抗性，所述菌胁迫可为真菌胁迫。所述真菌胁迫可为稻瘟病菌胁迫。
49、本技术中，所述抗旱性可为干旱迫下的抗性。所述干旱胁迫可为20％(w/v)peg6000胁迫。所述干旱胁迫可为20％(w/v)peg6000胁迫4天。本技术中，所述抗盐性可为盐迫下的抗性。所述盐胁迫可为150mm nacl胁迫。所述盐胁迫可为150mm nacl胁迫5天。
50、本技术中，所述抗冷性可为冷迫下的抗性。所述冷胁迫可为4℃胁迫。所述冷胁迫可为4℃胁迫4天。
51、上述的方法中，所述上调或增强或提高植物中上述蛋白质的编码基因的表达包括向所述目的植物中导入上述b1)所述的核酸分子、b2)所述的表达盒或b3)所述的重组载体。
52、上文中，所述核酸分子可为序列1所述的核酸分子。
53、如上任一所述的应用中，所述植物为如下任一种：
54、j1)禾本科植物；
55、j2)稻属植物；
56、j3)水稻。
57、本技术中，所述水稻可为日本晴。
58、如上所述的蛋白质。
59、上述的调控所述蛋白质的编码基因表达的物质。
60、有益效果
61、丝裂原活化蛋白激酶(mpk)级联反应在植物生长、发育和抵御病原体和胁迫中起着至关重要的作用。典型的mapk级联反应由三种激酶组成:map激酶激酶激酶(mapkkk)、map激酶激酶(mapkk)和map激酶(mapk)。到目前为止，许多mapk成员已经在水稻的发育过程以及生物和非生物胁迫信号转导中被报道。例如，osmpkk10.2-osmpk3级联调节oswrky30表达水平正向调控水稻抗旱性；osmkk1-osmpk4正调控水稻耐盐性；osmkk6-osmpk3正向调控水稻耐冷；osmpkk10.2-osmpk6正向调控水稻细菌性条斑病。
62、本发明发现了一个与抗逆性相关联的基因，将其命名为gnp3基因。所述抗逆性可为抗旱性、抗盐性(耐盐性)、抗冷性和抗菌性。
63、本发明构建了gnp3基因过表达载体，将其通过农杆菌eh105导入野生型日本晴，获得过gnp3基因表达植株gnp3-oe1、gnp3-oe6和gnp3-oe14，和，获得一株自然条件下由于t-dna插入导致gnp3基因功能缺失的突变株，将其命名为gnp3-1突变体(又称gnp3-1)
64、将wt(日本晴)gnp3-oe1、gnp3-oe6、gnp3-oe14和gnp3-1的幼苗在干旱胁迫、盐胁迫、冷胁迫和均胁迫下进行培养，结果表明，gnp3基因过表达植株在干旱胁迫、盐胁迫和冷胁迫条件下的生长表型和生存率均高于野生型对照(日本晴)，gnp3基因缺失植株在干旱胁迫、盐胁迫和冷胁迫条件下的生长表型和生存率均低于野生型对照(日本晴)，说明gnp3基因的表达在抗逆中发挥重要作用。接种过稻瘟菌液后，过表达gnp3基因的植株叶片的病斑远少于野生型，gnp3基因缺失植株则相反，表明过表达gnp3基因的植株的稻瘟菌抗性增强，而gnp3基因缺失植株稻瘟菌抗性减弱，说明gnp3基因的表达在抗稻瘟菌效果上发挥重要作用。
1.蛋白质、调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在下任一种中的应用；
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白来源于水稻。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述调控所述蛋白质的编码基因表达的物质为下述任一种：
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，b9)所述的核酸分子为核苷酸序列为序列1所示的dna分子。
5.一种培育高抗逆性水稻的方法，其特征在于，包括上调或增强或提高目的水稻中权利要求要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量，和/或，所述蛋白质的活性和/或含量得到高抗逆性水稻，所述高抗逆性水稻的抗逆性高于所述目的水稻。
6.一种提高水稻抗逆性的方法，其特征在于，包括将通过上调或增强或提高水稻中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达，和/或，所述权利要求1或2中所述蛋白质的活性和/或含量来提高水稻抗逆性。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述上调或增强或提高植物中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达包括向所述目的植物中导入权利要求3中b1)所述的核酸分子、b2)所述的表达盒或b3)所述的重组载体。
8.如权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述植物为如下任一种：
9.权利要求1所述的蛋白质。
10.权利要求3所述的调控所述蛋白质的编码基因表达的物质。
