本发明属于胆固醇检测，具体涉及一种检测胆固醇的探针系统及其应用。
背景技术：
1、胆固醇是哺乳细胞膜的主要组成成分，它可以影响细胞膜流动性，通透性及各种酶、转运体和受体的功能。哺乳动物细胞膜含有高达占细胞总胆固醇80％的胆固醇。脂筏是细胞膜上富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域，脂筏中的胆固醇一般位于脂相的细胞膜磷脂双层中，脂筏中的胆固醇可以通过招募特定分子到脂筏上从而触发各种细胞信号事件；而活性膜胆固醇，它是指当脂筏中胆固醇含量高于一定的阈值，超过磷脂的络合能力时，具有较高化学活性(逃逸倾向)的胆固醇，其一部分暴露于细胞膜周围的水相中。细胞膜内侧叶中的活性膜胆固醇可引起内质网反应、线粒体氧化甾醇反应等，同时活性膜胆固醇可以影响细胞内胆固醇运输以及多种离子转运通道或配体门控通道等功能。由此可见，监测细胞膜脂筏胆固醇和活性膜胆固醇，对了解细胞膜的功能、细胞内胆固醇运输和细胞信号转导等生理病理过程具有十分重要的意义。
2、近年来基于同位素、电化学传感器和荧光探针的胆固醇标记方法已经被开发出来，在这些方法中，同位素示踪和电化学传感器需要专门的环境、昂贵的实验仪器和训练有素的操作人员，因此限制了其广泛使用。荧光标记是一个有利的选择，也是最直观、经济和容易实践的。然而，目前还缺乏一种有效的荧光标记方法，能够选择性地有效地区分脂筏胆固醇和活性膜胆固醇。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种检测胆固醇的探针系统及其应用，达到更加特异和简便的细胞膜胆固醇标记，用于细胞膜内叶的脂筏胆固醇及活性膜胆固醇的荧光成像检测区分的目的。
2、通过改造能够特异性结合胆固醇的细菌穿孔毒素蛋白perfringolysin o(pfo)，仅截取其d4结构域能够使pfo失去细胞毒性而用于活细胞膜胆固醇标记，而perfringolysin o的d4结构域中丝氨酸t490与亮氨酸l491是特异性识别胆固醇并可能与羟基互相作用的位点。利用perfringolysin o d4结构域与mcherry荧光载体中的mcherry荧光蛋白融合表达，能够成功标记细胞膜胞浆侧的胆固醇，但单色荧光的mcherry-tag融合蛋白无法区分脂相中的脂筏胆固醇与水相中的活性膜胆固醇，故缺乏特异性。
3、进一步优化，将perfringolysin o的d4结构域经过疏水改造(y415a/d434w/a463wyda突变，体外能标记1％mol胆固醇)体外表达纯化后偶连溶致变色基团acrylodan，通过显微注射该荧光探针至细胞内标记胆固醇，从而实现区分特异结合膜中脂相的胆固醇(蓝色)和膜中近水相的胆固醇(绿色)，一定程度上可以解决细胞膜内叶胆固醇特异标记的问题。该方法虽然利用了溶致变色原理能够更加特异地检测膜胆固醇，但需要应用专门的显微注射仪器，操作麻烦繁琐，不利于广泛应用于众多缺乏显微注射仪的实验室。
4、再进一步优化，将snap标签与能够识别结合胆固醇的pfo的d4结构域融合得snap-d4蛋白，并通过慢病毒载体将snap-d4过表达与哺乳细胞内。同时合成溶致变色荧光染料acrylodan-bg(丙烯酰丹-苄氧基鸟嘌呤)。snap标签活性位点的半胱氨酸能够与bg(苄氧基鸟嘌呤)发生共价结合，从而形成acrylodan-bg/snap-d4荧光探针系统。由于acrylodan-bg在极性与非极性环境中发出不同颜色的荧光，即脂相中发出蓝光，水相中发出绿光，因此acrylodan-bg/snap-d4荧光探针系统能够感知细胞膜内叶脂相与部分暴露在水相的胆固醇，经证明分别为脂筏胆固醇与活性膜胆固醇。
5、本发明解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：
6、本发明目的在于提供一种检测胆固醇的探针系统，包括哺乳细胞表达的snap-d4融合蛋白和溶致变色荧光染料acrylodan-bg，哺乳细胞表达的snap-d4融合蛋白包含snap标签，snap标签活性位点的半胱氨酸与bg发生共价结合形成荧光探针系统。
7、进一步的，哺乳细胞表达snap-d4融合蛋白包含氨基酸序列seq id no.3。
8、进一步的，编码哺乳细胞表达的snap-d4融合蛋白包含核苷酸序列seq id no.4。
9、进一步的，编码哺乳细胞表达的snap-d4融合蛋白的表达细胞为huh-7细胞或l02细胞。
10、进一步的，snap-d4融合蛋白包含氨基酸序列seq id no.1。
11、进一步的，编码snap-d4融合蛋白包含核苷酸序列seq id no.2。
12、进一步的，编码snap-d4融合蛋白的表达菌株为bl21(de3)-plyss、rosetta(de3)、bl21-codonplus(de3)-ril中的一种。
13、进一步的，snap-d4融合蛋白为snap标签与pfo的d4结构域融合的融合蛋白，d4结构域为y415a/d434w/a463w yda突变体。
14、进一步的，溶致变色荧光染料acrylodan-bg的结构如下：
15、
16、一种检测胆固醇的探针系统在区分检测脂相胆固醇和水相胆固醇中的应用，应用于区分检测脂筏胆固醇与活性膜胆固醇荧光成像。
17、检测胆固醇的探针系统制备方法如下：
18、1、snap-d4蛋白大肠杆菌表达纯化方法，包括如下步骤：
19、a)将snap的基因序列与pfo的d4结构域(y415a/d434w/a463w yda突变体)核苷酸序列融合后连接到pet-22b克隆载体上构建表达snap-d4蛋白的大肠杆菌表达质粒pet-22b-snap-d4；
20、b)将大肠杆菌表达质粒pet-22b-snap-d4转化bl21(de3)-plyss、rosetta(de3)、bl21-codonplus(de3)-ril等菌株；
21、c)通过iptg诱导大肠杆菌表达snap-d4蛋白，收集包涵体蛋白进行变性、复性与纯化，得到纯化后的snap-d4蛋白；
22、d)纯化后的snap-d4蛋白可用于体外结合胆固醇。
23、2、稳定表达snap-d4的huh-7细胞系与l02细胞系构建方法，包括如下步骤：
24、a)将snap-d4的核苷酸序列连接到pcmv-hiv慢病毒克隆载体(来自和元生物)上构建表达snap-d4基因的慢病毒载体质粒pcmv-hiv-snap-d4；
25、b)将慢病毒载体质粒pcmv-hiv-snap-d4和包装质粒pspax2、pmd2.0g共转染293t细胞，包装成携带snap-d4编码基因的慢病毒；
26、c)将携带snap-d4编码基因的慢病毒感染huh-7细胞与l02细胞，并经过g418筛选后得到稳定表达的snap-d4 huh-7细胞系或snap-d4 l02细胞系；
27、d)稳定表达snap-d4的细胞系可结合细胞膜内叶胆固醇。
28、3、snap-tag的溶致变色荧光探针的合成，包括如下步骤：
29、a)结构式如下：
30、
31、b)合成路线如下：
32、
33、c)合成步骤如下：
34、将6-丙烯酰基-2-二甲氨基萘(acrylodan，化合物1)与o6-[4-(氨甲基)苄基]鸟嘌呤(bg-nh2，化合物2)溶于甲醇中，在氮气保护下于50℃恒温反应24h。反应完成后，冷却至室温，经硅胶柱分离纯化和减压蒸馏得到黄绿色固体产物3-((4-(((2-氨基-9h-嘌呤-6-基)氧基)甲基)苄基)氨基)-1-(6-(二甲基氨基)萘-2-基)丙-1-酮，即acrylodan-bg(化合物3)；
35、acrylodan-bg具有溶致变色性质并可在体内体外共价结合snap-d4蛋白，且acrylodan-bg/snap-d4探针系统可区分脂筏胆固醇与活性膜胆固醇。
36、与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
37、1、本发明的acrylodan-bg/snap-d4探针系统识别胆固醇具有特异性高，可操作性强等特点。细胞荧光成像显示脂筏胆固醇发出蓝色荧光，而胞膜中暴露于水相的胆固醇即活性膜胆固醇显示绿色荧光。本发明为脂筏胆固醇与活性膜胆固醇的区别检测提供了方法。
38、2、本发明中snap-d4融合蛋白具有结合胆固醇的功能，能够通过大肠杆菌表达与包涵体纯化后可在体外结合胆固醇，而通过慢病毒载体在哺乳细胞内稳定表达时则可在体内结合胆固醇。
39、3、本发明中溶致变色荧光染料acrylodan-bg拥有合成原料低价、方法简单等优点。
40、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述内容和其目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。
1.一种检测胆固醇的探针系统，其特征在于，包括哺乳细胞表达的snap-d4融合蛋白和溶致变色荧光染料acrylodan-bg，哺乳细胞表达的snap-d4融合蛋白包含snap标签，snap标签活性位点的半胱氨酸与溶致变色荧光染料acrylodan-bg的bg共价结合形成荧光探针系统。
2.如权利要求1所述一种检测胆固醇的探针系统，其特征在于：哺乳细胞表达的snap-d4融合蛋白包含氨基酸序列seq id no.3。
3.如权利要求2所述一种检测胆固醇的探针系统，其特征在于：编码哺乳细胞表达的snap-d4融合蛋白包含核苷酸序列seq id no.4。
4.如权利要求3所述一种检测胆固醇的探针系统，其特征在于：编码哺乳细胞表达的snap-d4融合蛋白的表达细胞为huh-7细胞或l02细胞。
5.如权利要求1所述一种检测区分胆固醇的探针系统，其特征在于：snap-d4融合蛋白包含氨基酸序列seq id no.1。
6.如权利要求5所述一种检测胆固醇的探针系统，其特征在于：编码snap-d4融合蛋白包含核苷酸序列seq id no.2。
7.如权利要求1或6所述一种检测胆固醇的探针系统，其特征在于：snap-d4融合蛋白为snap标签与pfo的d4结构域融合，并通过大肠杆菌表达与包涵体纯化后的融合蛋白，d4结构域为y415a/d434w/a463w yda突变体。
8.如权利要求7所述一种检测胆固醇的探针系统，其特征在于：编码snap-d4融合蛋白的表达菌株为bl21(de3)-plyss、rosetta(de3)、bl21-codonplus(de3)-ril中的一种。
9.如权利要求1所述一种检测胆固醇的探针系统，其特征在于：溶致变色荧光染料acrylodan-bg的结构如下：
10.如权利要求1-9任一项所述一种检测胆固醇的探针系统在区分检测脂相胆固醇和水相胆固醇中的应用，其特征在于：应用于区分检测脂筏胆固醇与活性膜胆固醇荧光成像。
