本发明涉及植物保护，更具体地涉及低温特异性生姜青枯菌、特异性片段及应用。
背景技术：
1、生姜为姜科姜属多年生草本植物,具有特殊的辛香风味和极高的药用价值,是世界范围内广泛应用的主要香辛类保健蔬菜之一。姜青枯病又称姜瘟病,是生姜产区普遍发生且危害最为严重的病害之一,其病原物为青枯假单胞杆菌，也有学者认为是青枯劳尔氏菌。感病植株一般在地面茎基部和地下根茎上先发病,最初为淡黄色水渍状病斑,之后组织逐渐软化、腐烂,仅残存表皮。姜青枯病病情发展迅速,一般病田可减产20％～30％,重病地块减产80％以上，且重病田3～5年内不能种植生姜,造成农民用地成本增加,经济损失严重。因此，迫切需要寻找一种有效的姜青枯菌检测手段，以期在发病前达到预防效果。
2、普通生姜青枯菌发病温度在28℃以上，在姜花的整个生长期中均可发生，而菌株rx08则在20～25℃就可感染生姜，并造成苗期姜瘟病，同时能在海拔800～1000米的高山地区越冬，成为第二年姜瘟病侵染源，且具有与现有报道的青枯菌不同的碳氮利用能力。此菌株具有种内特异性，可能具有更强的致病性和更长的发病周期，这一菌株的发现有助于全面了解生姜青枯病，有利于开发出针对来凤生姜青枯病更好的防控手段。
3、以cas12a开发的基因检测系统crispr/cas12a作为一种新的检测方式其目的在于快速检测,但是仅仅依靠crispr/cas12a系统进行检测无法达到较高的检测精度,在检测前首先进行靶基因片段的核酸扩增如pcr、lamp及rpa等方式,能够有效的提高检测精度。
4、在本发明中,为检测上述的菌株菌,我们将rpa技术与crispr/cas12a系统联合使用开发的rpa-crispr/cas12a新型分子诊断方式,通过37°℃恒温扩增目的片段,针对青枯菌的特异性片段﹐将检测结果通过试纸条的方式呈现。rpa-crispr/cas12a新型分子诊断方式通过较简单的实验器材和操作实现在基层一线对青枯病害进行初步的筛查﹐能够快速、有效的对病原菌侵染的生姜进行检测,将病害的发生发展控制在早期,实现有病无病的快速区分,减少生姜产业的损失,具有非常广阔的前景。
技术实现思路
1、针对上述问题,本发明的目的在于提供一种基于crispr/cas12a的对与现有模式和报道菌株存在基因组差异的菌株号为cctcc m 20232594的青枯菌高效检测方法和试剂盒。该方法将rpa技术与crispr/cas12a系统联合使用开发的rpa-crispr/cas12a新型分子诊断方式,通过37°℃恒温扩增目的片段,针对该青枯菌特异基因序列设计检测位点,将检测结果通过试纸条的方式呈现。rpa-crispr/cas12a新型分子诊断方式通过简单的实验器材和操作实现在基层一线对水产病害进行初步的筛查,能够快速、有效的对感病生姜进行检测,将病害的发生发展控制在早期，实现感病与健康生姜快速区分,减少经济损失,具有非常广阔的前景。
2、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
3、申请人从来自于凤县大河镇大河坝村患姜瘟病生姜中分离得到一株低温特异性生姜青枯菌(ralstonia solanacearum)，不同于其他的姜瘟病病原菌，本发明筛选的菌株在20～25℃能感染生姜，并造成苗期姜瘟病，同时能在海拔800～1000米的高山地区越冬，成为第二年姜瘟病侵染源，与现有报道的青枯菌具有不同的碳氮利用能力。该菌株已于2023年12月18日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：ralstonia solanacearumrx08，保藏编号为：cctcc no：m20232594，地址：中国武汉武汉大学。
4、针对该病原菌，申请人进行了全基因组测序，并进行比对，找到了该菌的特异性dna片段，该dna片段或该片段的检测试剂可用于ralstonia solanacearum rx08的检测。
5、本发明的保护范围包括：
6、上述菌株在建立低温姜瘟病感病模型中的应用。
7、检测seq id no.1所示序列的试剂在ralstonia solanacearum rx08检测中的应用。
8、以上所述的应用，优选的，所述的试剂为引物；
9、以上所述的应用，优选的，所述的引物包括rpa扩增体系引物，具体为：
10、rpa-d-7f:5’-tccggctgatccggctgatccggctgatc-3’和rpa-d-7r:5’-ggttagccgggttagccgggttagc-3’。
11、一种检测ralstonia solanacearum rx08的试剂盒，包括rpa扩增体系引物：rpa-d-7f:5’-tccggctgatccggctgatccggctgatc-3’和rpa-d-7r:5’-ggttagccgggttagccgggttagc-3’；和crispr/cas12a检测体系的crrna：5’-uaauuucuacuaaguguagaugggccgauugggccgauugggcc-3’。
12、一种基于crispr/cas12a的对ralstonia solanacearum rx08快速检测方法，包括以下步骤：
13、(1)提取待测样品dna；
14、(2)以步骤(1)提取的核酸为模板,将特异性rpa引物加入体外恒温扩增体系,39℃恒温反应15min,获得特异性rpa产物；
15、(3)利用crispr/cas12a检测体系通过免疫胶体金试纸条检测步骤(2)的待检测特异性rp a产物；
16、crispr/cas12a检测体系中使用的crrna为：5’-uaauuucuacuaaguguagaugggccgauugggccgauugggcc-3’。
17、与现有技术相比，本发明具有以下优点：
18、申请人首次筛选出一株低温特异性生姜青枯菌，该菌株与目前常规的姜瘟病病原菌不同，在20～25℃能感染生姜，并造成苗期姜瘟病，同时能在海拔800～1000米的高山地区越冬，成为第二年姜瘟病侵染源，因此该病原菌的筛选和检测，具备极大意义。
19、进一步的，为了便于检测，申请人将rpa技术与crispr/cas12a系统联合使用开发一种rpa-crispr/cas12a新型分子诊断方式,通过37°℃恒温扩增目的片段,针对rx08特异性序列设计检测位点,将检测结果通过试纸条的方式呈现。结合rpa对检测模板dna先进行预扩增后使crispr/cas12a的检测灵敏度大幅提升,使得rpa-crispr/cas12a在试纸条中的检测极限也能够达到1.45f g/μl，该方法能够快速、有效的对青枯病进行检测,将病害的发生发展控制在早期,实现发病与健康生姜的快速区分,减少经济损失,具有非常广阔的前景。
1. 一株分离的青枯菌（ralstonia solanacearum）rx08，所述菌株的保藏编号为：cctcc no：m20232594。
2.权利要求1所述菌株在建立低温姜瘟病感病模型中的应用。
3. 分离自权利要求1所述青枯菌的dna片段，为seq id no.1所示。
4. 检测seq id no.1所示序列的试剂在ralstonia solanacearum rx08检测中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，所述的试剂为引物。
6.根据权利要求5所述的应用，所述的引物包括rpa扩增体系引物，具体为：
7. 一种检测ralstonia solanacearum rx08的试剂盒，包括rpa扩增体系引物：rpa-d-7f: 5’- tccggctgatccggctgatccggctgatc-3’和rpa-d-7r: 5’-ggttagccgggttagccgggttagc-3’；和crispr/cas12a检测体系的crrna：5’-uaauuucuacuaaguguagaugggccgauugggccgauugggcc-3’。
8. 一种基于crispr/cas12a的对ralstonia solanacearum rx08快速检测方法，包括以下步骤：
