本发明属于痕量检测，具体涉及猪伪狂犬病毒荧光定量pcr检测的引物对、探针和试剂盒。
背景技术：
1、猪伪狂犬病(pseudorabies，pr)是由伪狂犬病毒(pseudorabies virus，prv)感染引起的以发热、腹泻、繁殖障碍和呼吸系统症状为主的急性接触性传染病。猪是prv的天然宿主，还可以感染牛、羊、猫等多种哺乳动物。育肥猪感染prv后，会出现发热和呼吸道症状，耐过后形成潜伏感染，终身排毒。本病是危害养猪业的重大传染病之一，在我国被列为二类动物疫病。
2、目前，针对prv的检测方法主要是血清学检测技术和分子生物学检测技术。血清学检测技术是实验室常规检测技术之一，广泛应用于畜禽病原微生物的抗原或抗体的检测。prv的血清学检测方法主要elisa、免疫层析技术以及荧光微球免疫检测方法等。elisa操作简单、准确性高、实用性强，且抗体检测结果可以实现定量或半定量分析；免疫层析技术主要借助免疫层析试纸条完成，其操作简便、检测快速，而且携带方便，也是现场即时检测；荧光微球免疫检测方法具有灵敏度高、支持抗原/抗体多重检测且可实现靶标快速分离等优势，为prv快速检测提供了新的支持。由于动物在感染初期，不会立即产生特异性抗体，基于抗体检测的方法具有滞后性，不能实现及时诊断。而抗原抗体具有交叉反应性，容易受其他干扰物的影响，所以在特异性方面上述方法仍有待提升。
3、分子生物学检测技术具有灵敏性较高、检测时间短和批量检测临床样本等优势，是检测技术中应用最广泛的一种。传统pcr的产物需要在反应结束后单独检测，如琼脂糖凝胶电泳，其操作繁琐，只能定性分析。而荧光定量pcr技术将扩增产物的实时变化转变成荧光信号，实现反应的即时检测和定量分析，灵敏度比传统pcr技术提高100倍。其中，荧光定量pcr技术分为荧光染料法和taqman探针法，荧光染料法是染料与双链dna的非特异性结合，因此可能产生假阳性的结果；taqman探针法是引物和一个特异性的荧光探针，特异性强，灵敏度高。
4、taqman探针法的荧光定量pcr，每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步。在每一次pcr扩增时，增加荧光分子释放的数量，理论上可以提高荧光信号的累积以提高检测的灵敏度。在以往的研究中，非洲猪瘟病毒检测成功通过增加荧光探针的数量以提高灵敏度，如一种高灵敏taqman实时荧光定量pcr检测核酸的方法(公告号cn116732150a)。
5、因此，重新设计taqman探针提升taqman荧光定量pcr灵敏度，是目前能更好的应对流行的猪伪狂犬病毒的检测方法。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种猪伪狂犬病毒荧光定量pcr检测的引物对和探针及试剂盒。本发明旨在建立一种痕量检测方法，为待测物种核酸的高灵敏检测提供一种新思路。
2、为达到上述目的，本发明提供了猪伪狂犬病毒荧光定量pcr检测的引物对和探针组合，包括用于扩增猪伪狂犬病毒的1组特异性引物和至少1条在引物对的扩增靶标区域内的taqman探针；
3、所述特异性引物对如下：
4、正向引物(prv-f)：gtcaccgaggtcccgagt
5、反向引物(prv-r)：ggacacgttcaccagatggg
6、所述的探针不少于2条，所述taqman探针的序列如下：
7、prv-fp1：ctcggccgaggtctgggacgacctctcc
8、prv-fp2：ccgaggccgacgacgatgacctcaac
9、prv-rp3：cggcggtcgtcgccgtcgaggtc
10、prv-rp4：atgcgagggccgagccgaagcc
11、每条所述taqman探针序列都结合有相同的荧光基团，在5′端结合有荧光报告基团，在3′端结合有荧光淬灭基团。
12、进一步，所述taqman探针序列的5′端标记荧光物质为标记fam，所述taqman探针序列的3′端标记淬灭物质为标记bhq1。
13、本发明还提供了猪伪狂犬病毒荧光定量pcr检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物对和探针组合。
14、本发明还提供了猪伪狂犬病毒荧光定量pcr检测核酸的方法，包括以下步骤：
15、s1.提取待测样品中的核酸；
16、s2.利用上述引物对和探针组合配置taqman实时荧光定量pcr体系；
17、s3.将步骤s2配置的反应体系置于荧光定量pcr仪中，进行扩增反应；
18、s4.检测扩增曲线。
19、进一步，所述步骤s2中，taqman实时荧光定量pcr体系包括：taqman qpcrmix 12.5μl，prv-f、prv-r各0.5μl，探针各0.25μl，待测样品核酸5μl，余量用ddh2o补足至25μl。
20、进一步，所述步骤s2中，引物对浓度均为10μmol/l。
21、进一步，所述步骤s2中，探针浓度均为10μmol/l。
22、进一步，所述步骤s3中，扩增反应的反应条件为：95℃、3min；95℃、10s，59℃、30s，扩增40个循环。
23、有益效果：
24、本发明提供了猪伪狂犬病毒荧光定量pcr检测的引物对、探针及试剂盒，利用荧光信号累积的特点，设计至少含1条特异性探针的反应体系，该探针在外切酶的活性下被切割，分离荧光基团和淬灭基团，释放荧光信号。本发明利用多探针策略，成功构建高灵敏性taqman实时荧光定量pcr检测方法。本发明以猪伪狂犬病毒为例，通过设计prv ge基因的多探针并比较不同数量的探针以及不同探针的组合之间的灵敏性，从而有效的提高了taqman实时荧光定量pcr检测的灵敏性，最低检测限可到达0.5～10copies/μl。
25、本发明所述检测方法，其组内变异系数小于1％，重复性良好，且与pcv2、csfv、prrsv、pedv无交叉反应，具有良好的特异性。
26、本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究，对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
1.猪伪狂犬病毒荧光定量pcr检测的引物对和探针组合，其特征在于：包括用于扩增猪伪狂犬病毒的1组特异性引物和至少1条在引物对的扩增靶标区域内的taqman探针；
2.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒荧光定量pcr检测的引物对和探针组合，其特征在于：所述taqman探针序列的5′端标记荧光物质为标记fam，所述taqman探针序列的3′端标记淬灭物质为标记bhq1。
3.猪伪狂犬病毒荧光定量pcr检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对和探针组合。
4.猪伪狂犬病毒荧光定量pcr检测核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述猪伪狂犬病毒荧光定量pcr检测核酸的方法，其特征在于：所述步骤s2中，taqman实时荧光定量pcr体系包括：taqman qpcr mix 12.5μl，prv-f、prv-r各0.5μl，探针各0.25μl，待测样品核酸5μl，余量用ddh2o补足至25μl。
6.根据权利要求4所述猪伪狂犬病毒荧光定量pcr检测核酸的方法，其特征在于：所述步骤s2中，引物对浓度均为10μmol/l。
7.根据权利要求4所述猪伪狂犬病毒荧光定量pcr检测核酸的方法，其特征在于：所述步骤s2中，探针浓度均为10μmol/l。
8.根据权利要求4所述猪伪狂犬病毒荧光定量pcr检测核酸的方法，其特征在于：所述步骤s3中，扩增反应的反应条件为：95℃、3min；95℃、10s，59℃、30s，扩增40个循环。
