本发明涉及内毒素检测领域，具体涉及一种基于单分子阵列免疫分析仪的内毒素检测方法，通过形成“靶向肽包被磁珠-内毒素-生物素化检测肽-sβg”酶标复合物体系及酶催化底物产生荧光对内毒素进行检测。
背景技术：
1、内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，又称为脂多糖，典型的内毒素分子由三部分组成，脂质a、核心低聚糖和o特异性多糖。内毒素性质稳定且耐热，当低剂量的内毒素进入宿主体内时，就会产生严重的生物效应，如：发热、寒战、低血压、成人呼吸窘迫综合征、弥散性血管内凝血和内毒素休克等。因此，内毒素的检测对疾病的诊断治疗、无菌药物生产和医疗器械的质量控制十分重要。
2、内毒素常用的检测方法是家兔热原法和鲎试剂检测法。家兔热原法灵敏度较低，且操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控。鲎试剂检测法灵敏度较家兔热原法高，但其来源受限，成本较高，不适用于大量的内毒素检测。且部分人群对鲎试剂存在过敏反应，这一点也限制了鲎试剂的应用。因此，开发一种灵敏度较高、来源不受限、操作简单且成本较低的内毒素检测方法仍是一大挑战。
技术实现思路
1、为解决现有技术的问题，本发明提供一种基于单分子阵列免疫分析仪的内毒素检测方法。
2、一种基于单分子阵列免疫分析仪的内毒素检测方法，所述的方法包括如下步骤：
3、1)利用活化试剂对羧基磁珠表面羧基进行活化，再在一定条件下与靶向肽进行偶联，形成靶向肽包被磁珠，得到偶联后的磁珠。
4、2)偶联后的磁珠经缓冲液洗涤后，在一定条件下加入封闭液对羧基进行封闭，得到封闭后的靶向肽包被磁珠。
5、3)封闭后的靶向肽包被磁珠经缓冲液洗涤后，重悬于pbs缓冲液，加入内毒素样品进行孵育，使内毒素与靶向肽相结合，得到反应后的靶向肽包被磁珠。
6、4)反应后的靶向肽包被磁珠经缓冲液洗涤后，加入生物素化检测肽进行孵育，形成靶向肽包被磁珠-出毒素-生物素化检测肽夹心体系。
7、5)反应后的靶向肽包被磁珠经缓冲液洗涤后，加入链霉亲和素-β-半乳糖苷酶(sβg)进行孵育，形成靶向肽包被磁珠-内毒素-生物素化检测肽-sβg复合物体系。
8、6)复合物体系经缓冲液洗涤后，重悬于pbs上样液，载入深孔板，加入试卤灵-β-d-半乳糖吡喃糖苷，使用单分子阵列免疫分析仪进行检测。
9、对于上文的技术方案中，步骤1)所述的羧基磁珠的直径为3.0-3.2μm；羧基磁珠的规格2.9×108-3.5×108个/ml。
10、对于上文的技术方案中，步骤1)所述的活化羧基使用的活化试剂包括edc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、nhs(n-羟基丁二酰亚胺)(sulfo-nhs，n-羟基硫代琥珀酰亚胺)；所述活化试剂以溶液的形式加入，活化试剂溶液是以mes溶液为溶剂，mes溶液的ph为5.0-7.0，优选ph 6.0；羧基磁珠与活化试剂溶液的体积比为1∶1-1∶3，优选情况下，羧基磁珠与活化试剂溶液体积比为1∶2-1∶3。当活化试剂为edc与nhs或sulfo-nhs混合使用时，edc与nhs或sulfo-nhs的摩尔浓度比为1∶1-1∶5，优选的情况下，edc与nhs或sulfo-nhs的摩尔浓度比为1∶2；优选的情况下，活化试剂为edc与nhs；活化试剂edc与nhs的摩尔浓度比为1∶1-1∶5，优选的情况下，edc与nhs的摩尔浓度比为1∶2；羧基磁珠与edc和nhs溶液的体积比为1∶1-1∶3，优选情况下，羧基磁珠与edc和nhs溶液体积比为1∶2-1∶3。
11、对于上文的技术方案中，步骤1)具体为：向羧基磁珠中加入活化试剂溶液，对羧基磁珠表面羧基进行活化，得到活化后的磁珠，经缓冲液洗涤后，加入靶向肽溶液进行孵育，形成靶向肽包被磁珠，得到偶联后的磁珠。
12、对于上文的技术方案中，步骤1)所述的活化羧基的活化温度为10-25℃，优选10℃；活化时间为30-60min，优选30min；活化ph为5.0-7.0，优选ph 6.0。
13、对于上文的技术方案中，步骤1)所述的靶向肽的序列为hwkavnwlkpwt；所述的靶向肽偶联时间为3-24h，优选24h；偶联温度为15-35℃，优选20-30℃；所述的靶向肽以溶液的形式加入，所述的靶向肽溶液的浓度为0.1-0.5mg/ml，优选0.25-0.5mg/ml；所述的靶向肽溶液与羧基磁珠的体积比为1∶1-1∶4，优选1∶1-1∶2。
14、对于上文的技术方案中，步骤2)所述的封闭液为含bsa(牛血清白蛋白)、pei(聚醚酰亚胺)、l-lys(l-赖氨酸)、poloxamer 407(泊洛沙姆407)、l-arg(l-精氨酸)、l-pro(l-脯氨酸)中一种或多种的pbs缓冲液，优选含l-lys的pbs缓冲液；所述的封闭液的质量浓度为0.5％-5.0％，优选2.5％-5.0％；所述的封闭液与羧基磁珠的体积比为1∶2-2∶1，优选1∶1-2∶1。
15、对于上文的技术方案中，步骤2)所述的封闭温度为4-25℃，优选25℃，封闭时间为1-12h，优选1h。
16、对于上文的技术方案中，步骤3)所述的用于重悬的pbs缓冲液与羧基磁珠的体积比为1∶5-1∶15，优选1∶8-1∶10。
17、对于上文的技术方案中，步骤3)中，可以取一定量重悬于pbs缓冲液的已封闭的磁珠，加入内毒素样品进行孵育，使内毒素与靶向肽相结合，得到反应后的靶向肽包被磁珠。例如，重悬于pbs缓冲液的羧基磁珠的用量为10-20μl，优选10-15μl。
18、对于上文的技术方案中，步骤3)中，重悬于pbs缓冲液的羧基磁珠与内毒素样品的体积比为1∶10-1∶20，优选1∶10-1∶15。
19、对于上文的技术方案中，步骤3)所述的内毒素样品为内毒素标准品溶液或含有内毒素的样品溶液。
20、对于上文的技术方案中，步骤3)所述的内毒素孵育时间为30-60min，优选60min；孵育温度为15-35℃，优选20-30℃。
21、对于上文的技术方案中，步骤4)所述的生物素化检测肽为biotin-ssffhlrhhahl；所述的生物素化检测肽孵育时间为30-60min，优选60min；孵育温度为15-35℃，优选20-30℃；所述的生物素化检测肽以溶液的形式加入，所述的生物素化检测肽的浓度为0.1-0.5μg/ml，优选0.2-0.4μg/ml；所述的生物素化检测肽与步骤3)重悬于pbs缓冲液的羧基磁珠的体积比为10∶3-24∶3，优选为14∶3-24∶3。
22、对于上文的技术方案中，步骤5)所述的sβg以溶液的形式加入，加入的sβg溶液的浓度为40-160pm，优选40-80pm；所述的sβg与步骤3)重悬于pbs缓冲液的羧基磁珠的体积比为2∶1-16∶3，优选为3∶1-14∶3；孵育时间为5-10min，优选5min；孵育温度为15-35℃，优选20-30℃。
23、对于上文的技术方案中，步骤6)所述的pbs上样液为pbs缓冲液，10-50mm，ph6.8-7.8，优选10-20mm，ph 7.0-7.5；所述的pbs上样液与步骤3)重悬于pbs缓冲液的羧基磁珠的体积比为2∶3-5∶3，优选为1∶1-4∶3。
24、对于上文的技术方案中，步骤6)所述的试卤灵-β-d-半乳糖吡喃糖苷与步骤3)重悬于pbs缓冲液的羧基磁珠的体积比为1∶3-4∶3，优选为2∶3-4∶3。
25、对于上文的技术方案中，所述的缓冲液为含tween-20pbs缓冲液(10mm，ph 7.4)，tween-20质量分数为0.05％-5％，优选1％-1.25％。
26、对于上文的技术方案中，所述的复合物洗涤次数为5-9次，优选9次。
27、有益效果：
28、本发明通过形成“靶向肽包被磁珠-内毒素-生物素化检测肽-链霉亲和素-β-半乳糖苷酶”复合物体系，经酶促反应产生荧光，通过统计荧光增长值得到内毒素浓度。上述体系的检测范围为0～200pg/ml，检测限为0.2pg/ml，实现了无需鲎试剂、操作简单且成本较低的内毒素检测。
1.一种基于单分子阵列免疫分析仪的内毒素检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的活化羧基使用的活化试剂包括edc溶液、nhs或sulfo-nhs溶液，edc溶液与nhs或sulfo-nhs溶液的摩尔浓度比为1∶1-1∶5；所述的活化羧基的活化温度为10-25℃，活化时间为30-60min，活化ph为5-7。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的靶向肽的序列为hwkavnwlkpwt；所述的靶向肽偶联时间为3-24h，偶联温度为15-35℃；所述的靶向肽以溶液的形式加入，靶向肽溶液与羧基磁珠的体积比为1∶1-1∶4。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的封闭液为含bsa、pei、l-lys、poloxamer 407、l-arg、l-pro中一种或多种的pbs缓冲液；所述的封闭液的质量浓度为0.5％-5.0％，所述的封闭液与羧基磁珠的体积比为1∶2-2∶1；所述的封闭温度为4-25℃，封闭时间为1-12h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的内毒素孵育时间为30-60min，孵育温度为15-35℃；所述的用于重悬的pbs缓冲液与羧基磁珠的体积比为1∶5-1∶15，重悬于pbs缓冲液的羧基磁珠与内毒素样品的体积比为1∶10-1∶20。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述的生物素化检测肽为biotin-ssffhlrhhahl；所述的生物素化检测肽孵育时间为30-60min，孵育温度为15-35℃；所述的生物素化检测肽的浓度为0.1-0.5μg/ml，所述的生物素化检测肽与步骤3)重悬于pbs缓冲液的羧基磁珠的体积比为10∶3-24∶3。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中，链霉亲和素-β-半乳糖苷酶孵育时间为5-10min，孵育温度为15-35℃；所述的链霉亲和素-β-半乳糖苷酶以溶液的形式加入，链霉亲和素-β-半乳糖苷酶溶液的浓度为40-160pm；所述的链霉亲和素-β-半乳糖苷酶溶液与步骤3)重悬于pbs缓冲液的羧基磁珠的体积比为2：1-16：3。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)中，所述的pbs上样液为pbs缓冲液，所述的pbs上样液与步骤3)重悬于pbs缓冲液的羧基磁珠的体积比为2∶3-5∶3，所述的试卤灵-β-d-半乳糖吡喃糖苷与步骤3)重悬于pbs缓冲液的羧基磁珠的体积比为1∶3-4∶3。
9.根据权利要求1所述的方法，其特+征在于，所述的缓冲液为含tween-20的pbs缓冲液，tween-20的质量分数为0.05％-5％。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的复合物洗涤次数为5-9次。
