本发明属于生物工程，涉及利用两步巢式pcr技术扩增猪胚胎单细胞dna，进行早期胚胎性别鉴定的方法。
背景技术：
1、哺乳动物胚胎性别鉴定技术是一项具有重要意义的技术，它在动物生产、育种和基础研究等方面都具有广泛应用价值。在日常生产中，通过性别鉴定可以控制物种子代的性别比例，提高优势品系选择的强度，减少性别相关疾病的发生，加速动物遗传育种进程，有利于物种群体自我更新，从而充分发挥优势性别的经济效益；在基础研究方面，性别鉴定是进行x染色体失活和性别决定等研究的前提条件。同时，在保护珍稀动物和濒危物种、维护生物多样性和生态平衡等方面也具有重要意义。
2、家畜胚胎早期育种选择往往是在囊胚期，甚至是卵裂期，这个时期一个胚胎往往只有几个到几十个细胞，能够提供给鉴定用的样本数量非常有限，因为取的细胞数量越多对胚胎的损伤越大，甚至导致胚胎发育阻滞。因此，人们更加关注微量样本的性别鉴定技术，尤其是单个细胞样本，但一个细胞只有2套基因组，雌性细胞具有2条x染色体或雄性x、y染色体各1条，因此，对鉴定方法的准确性、稳定性和灵敏性要求非常高。
3、随着细胞学、免疫学、分子生物学等相关学科的不断发展，胚胎性别鉴定方法也变得越发多样化。目前，常用的鉴定方法包括常规染色体核型分析法、免疫荧光法、原位杂交法等，但以上方法大部分都需要很多的细胞样本，并且操作繁琐；其中，免疫荧光法和原位杂交法虽然可以进行少量细胞检测，但需要固定胚胎，并且操作时间长、技术要求高，易造成假阴性，不适合产业应用。相比之下，pcr法具有高效灵敏、低成本、操作简单、稳定性强、重复性好等显著优点。但传统的利用纯化法提出dna后再进行pcr的策略无法满足微量样本的鉴定，因为纯化pcr过程中很大概率会损失基因组样本，导致结果假阴性，并且使用裂解液裂解胚胎细胞的同时也容易发生裂解不充分以及损伤dna的情况，所以pcr前期样本的处理也是非常关键的。
技术实现思路
1、本发明为解决现有技术中的胚胎细胞性别鉴定技术存在操作繁琐、操作时间长、技术要求较高，准确性、稳定性和灵敏性较低的技术问题，提供了一种基于两步巢式pcr技术鉴定猪胚胎单细胞性别的方法。
2、本发明的目的之一在于提供一种基于两步巢式pcr法鉴定猪胚胎单细胞性别的方法，包括以下步骤：
3、s1.获取待鉴定的猪胚胎细胞基因组dna；
4、s2.设计并合成用于鉴定猪胚胎单细胞性别的引物；
5、s3.以s1中获得的dna为模板与s2中获得引物进行1轮pcr扩增，在以1轮pcr扩增产物为模板进行2轮pcr扩增；
6、s4.对s3中获得的2轮pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据条带情况鉴定胚胎性别。
7、在本发明的一种优选实施例中，s1中所述的胚胎为活体采胚、经体外受精产生的胚胎或冻胚。
8、在本发明的一种优选实施例中，s1中所述胚胎细胞基因组dna的获取步骤为：通过体外受精获取胚胎细胞，然后建立细胞裂解体系，获得胚胎细胞基因组dna。
9、在本发明的一种优选实施例中，所述体外受精获取胚胎细胞的过程为：使用mtbm培养液将新鲜猪精子稀释到为3×105/ml，然后通过体外受精技术与mtbm清洗后的卵母细胞在50ml的mtbm精液中进行授精，持续6h，然后清洗胚胎并置于pzm-3培养液中以39℃、5％co2、饱和湿度的环境培养6.5d，获得胚胎细胞。
10、在本发明的一种优选实施例中，所述细胞裂解体系的建立步骤为：先向单个胚胎细胞pcr管中加入3μl的裂解液，然后加入1μl的20mg/ml蛋白酶k试剂，再加入0.5μl的10mg/ml rnasea试剂，最后将0.5μl的单个细胞样本加入新鲜配置的4.5μl的裂解液中，获得胚胎细胞基因组dna。
11、在本发明的一种优选实施例中，s2中所述的引物为：
12、amel-1st-f：catatctgcmtcctgtcy；
13、amel-1st-r：actgacaaacatcctgaatg；
14、amel-2nd-f：csacaagaccaagatgct；
15、amel-2nd-r：aaggagaagaagaagagtgag。
16、在本发明的一种优选实施例中，s3中所述的扩增体系为：
17、第1轮扩增体系：kod酶10μl，10nm上、下游引物各0.5μl，10细胞裂解产物作为模板4μl，ddh2o 5μl；
18、第2轮扩增体系：kod酶10μl，10nm上、下游引物各0.5μl，第1轮扩增产物作为模板3μl，ddh2o 6μl。
19、在本发明的一种优选实施例中，s3中所述的扩增条件均为：在95℃下预变性30s后，95℃变性10s，再在60℃退火延伸20s，该过程循环40次。
20、在本发明的一种优选实施例中，s4中所述的凝胶电泳检测为2％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件为130v，30min。
21、在本发明的一种优选实施例中，s4中所述的鉴定方法为，当出现2条电泳条带时为雄性，1条电泳条带时为雌性。
22、本发明的有益效果：
23、本发明提供了一种基于两步巢式pcr技术鉴定猪胚胎单细胞性别的方法，其中，细胞样本前期处理中添加的裂解液能够迅速破碎胚胎单细胞膜和核膜，释放基因组dna；添加的蛋白酶k具有降解蛋白的作用，添加的rnasea具有降解核糖核酸的作用，有助于消除核糖核酸对鉴定结果的干扰，提高性别鉴定的准确性。
24、本发明对巢式pcr鉴定体系进行了优化，确定了最优的体系。首先我们将单个细胞的裂解液进行了优化，只有使用我们优化的裂解液裂解单个细胞并将裂解物作为pcr模板才能有效扩增出条带；其次，将常规pcr酶替换为kod酶，在现有技术中未发现有将kod酶用于pcr扩增的，并发现kod酶扩增效果更强，条带清晰无杂带，特异性较好；本发明提供的巢式pcr鉴定体系可以实现10个以上细胞样本的性别鉴定，并确定amel引物组扩增效率明显较高，灵敏度更强，且可以简化加样体系，本发明实现了在单个细胞数量的条件下对于胚胎细胞性别的准确鉴定。通过dna-fish验证本发明提供的巢式pcr技术胚胎性别鉴定体系的可靠性和准确性，而且本发明提供的鉴定方法具有操作简单、鉴定周期短的优点，适合产业应用。
25、本发明提供的两步巢式pcr技术极大地提高了pcr的灵敏性，与常规pcr鉴定结果相比较，获得的电泳条带清晰无非特异性扩增，具有较高的灵敏性；本发明通过改变模板和引物的方式，降低了pcr扩增过程中非特异性序列被连续放大的可能性，保证了反应的特异性，进而提高了性别鉴定结果的准确性。此外，巢式pcr由于存在多组引物，其2轮引物扩增的是以1轮引物扩增产物为模板，2轮扩增均是对1轮反应的进一步鉴定，从而保证了整个扩增体系的准确性和可行性。因此，本发明通过两步巢式pcr扩增技术解决了单细胞样本中sry等性别决定基因的单拷贝所带来的pcr扩增效率低、灵敏性差的问题，从而提高单个细胞样本性别鉴定的准确性。
1.一种基于两步巢式pcr技术鉴定猪胚胎单细胞性别的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，s1中所述的胚胎为活体采胚、经体外受精产生的胚胎或冻胚。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，s1中所述胚胎细胞基因组dna的获取步骤为：通过体外受精获取胚胎细胞，然后建立细胞裂解体系，获得胚胎细胞基因组dna。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述体外受精获取胚胎细胞的过程为：使用mtbm培养液将新鲜猪精子稀释到为3×105/ml，然后通过体外受精技术与mtbm清洗后的卵母细胞在50ml的mtbm精液中进行授精，持续6h，然后清洗胚胎并置于pzm-3培养液中以39℃、5％co2、饱和湿度的环境培养6.5d，获得胚胎细胞。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞裂解体系的建立步骤为：先向单个胚胎细胞pcr管中加入3μl的裂解液，然后加入1μl的20mg/ml蛋白酶k试剂，再加入0.5μl的10mg/ml rnasea试剂，最后将0.5μl的单个细胞样本加入新鲜配置的4.5μl的裂解液中，获得胚胎细胞基因组dna。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，s2中所述的引物为：
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，s3中所述的扩增体系为：
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，s3中所述的扩增条件均为：在98℃下预变性5min后，98℃变性10s，60℃退火5s，68℃延伸10s，68℃延伸10min，该过程循环40次。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，s4中所述的凝胶电泳检测为2％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件为130v，30min。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，s4中所述的鉴定方法为：当出现2条电泳条带时为雄性，1条电泳条带时为雌性。
